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1. 问题:有目的基因,293t细胞,如何用慢病毒载体整合入293t细胞,求详细过...
2. 慢病毒包装的简要流程
3. 如何养293、293T系列的细胞?

1、问题:有目的基因,293t细胞,如何用慢病毒载体整合入293t细胞,求详细过...

第一天：用无抗生素DMEM 10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度 第二天：转染293FT细胞。

含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5）分装、-80℃保存。

利用HIV病毒将自身基因组插入整合到宿主基因组的特性。在293T细胞内先转染三个质粒，分别为HIV病毒合成所需要的组分（改造过的），其中一个带有装配入病毒衣壳信号序列的质粒上插入要稳转的序列。

T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率， 应尽量选择传代次数少， 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看， 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。

将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS EDTA（0.02%），来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM，混匀，不能吹打，分装2瓶。

2、慢病毒包装的简要流程

慢病毒包装简要程序（以六孔板中的1孔为例）：第一天：用无抗生素DMEM 10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度 第二天：转染293FT细胞。

慢病毒包装简要流程：1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3） 培养 48hrs – 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。

慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

目前比较广泛采用的第三代包装系统——四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。

3、如何养293、293T系列的细胞?

应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下， 防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻293T 细胞的冻存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亚砜， 复苏率很高。

养293细胞和293T一样。以293T为例，预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求可想而知有多难？由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。

随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

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