蛋白质组学流程-蛋白质组学基本原理

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第二步：蛋白裂解，因为蛋白被福尔马林或甲醇固定得非常紧了，有的人会选择加入水，让样品泡涨，我们更推荐加入裂解液（0.1M Tris-HCI， pH 0， 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白样品，然后匀浆和超声。第三步：水化之后，加入4%SDS。

用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。选择性变性沉淀法（1）例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。

蛋白质组学研究的主要步骤如下：蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接影响到科学研究的真实性和可信度。

样品处理的一致性：在整个实验过程中，应该尽量保持样品处理的一致性，以避免引入人为误差。使用相同的方法和条件来处理不同的样品，包括对照组和实验组。样品保存：蛋白质样品在采集后应立即处理或冷藏保存。

这个概念最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

此外，随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究方向，如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。

蛋白质组学（proteomics）研究即旨在解决这一问题。

基因组研究的结果表明，一个基因组拥有的“基因”数目是由两部分组成的：通过实验证明确有蛋白质产物的真实基因、根据起始密码和终止密码序列所确定的潜在基因。

蛋白质组学的基本技术流程主要为以下四方面。

蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接影响到科学研究的真实性和可信度。

LCM-二维电泳·质道的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。

蛋白质组学研究的基础技术主要包括以下两个方面：二维电泳（2-DE）：二维电泳是一个用于分离蛋白质的技术，其中第一维度是按照蛋白质的等电点分离，而第二维度是按照蛋白质的分子量分离。

蛋白质组学的研究策略主要包括如下：质谱法：通过测量蛋白质的质量来研究其特性，包括串联质谱技术（MS/MS）用于确定蛋白质的氨基酸序列和翻译后修饰等信息。

蛋白质组学的研究方法有蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定、蛋白质靶向定量技术。蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。

利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：对盐，DNA等杂质高度敏感。对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。对PH和MW的范围有所限制。耗时，无法自动化。

所得沉淀物用一生中适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。

四次重复实验检测发现，用这种装置做下来，四次都能被重复的蛋白有99%，只有6%的蛋白是其中任意一次单独鉴定到的，5%是其中两次鉴定到的，0%是其中三次鉴定到的。

此方法可分为：1）利用表面活性剂（三氯乙酸）或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。

目前都以3次生物学重复实验设计为主，要求严格的实验可以做5次重复。技术重复：指对同一样本进行重复地检测分析，例如同一份细胞中抽提的蛋白质进行三次质谱检测，或者对同一RNA-seq样本测序3次。

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