蛋白质组学需要多少样本量(蛋白质组学样本收集要求)
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1、关于TMT/iTRAQ和DIA技术的选择?
DIA无需指定目标肽段,扫描点数均匀,利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选,并可实现数据回溯。
其中,相对定量技术又可分为标记技术(TMT和iTRAQ)和非标记技术(label-free、DIA)。标记相对定量技术中TMT标签可增加样品通量到16个。然而, TMT方法需要多级的肽分级来获得深入的蛋白质组图谱,并且1-2个TMT通道常用于检测所有样品的混样来减少批间差,这降低了各个项目之间进行有效比较的能力,并增加检测成本。
如果做iTRAQ(或TMT)标记,最好用TEAB,而不是碳酸氢铵体系。因为iTRAQ(或TMT)试剂是标记末端氨基,碳酸氢铵上的氨基也会被标记上,影响蛋白的标记效率。 酶的用量可以参考以下的公式: W(酶):W(底物)=1:20 – 1:50 此外,需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素,且不能与SDS同时使用。
“样品重复”,也可以称为生物重复。生物重复是指样品来自同一处理组的不同样品,是整个实验的完全重复,如平行培养的细胞或细胞株。技术重复是指对同一生物样品进行重复实验,可降低实验中的测量误差或背景噪音。上机重复是指是指同一样品进行重复上机检测。
rna保护液可以提蛋白,RNA长效保存液是一种能高效抑制RNase活性的新型小分子混合物,用于防止RNase对RNA的降解作用。组织RNA长效保护液从新鲜组织细胞中提取RNA时,由于各种原因若不能马上处理样品,即使-70℃保存样品中的RNA也不稳定容易降解,而液氮保存既昂贵又不方便。
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