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1. 提取rna的关键步骤是？

1、提取rna的关键步骤是？

细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％，tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，由于rRNA占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA，它也有三种类型：28S，18S，5S。所以我们看到的也应该是三条带，而且28S的亮度为18S的两倍。这样的RNA才可以用来建库。

在RNA的提取时，一定要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,，可以不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。

下面是两种提取方法，第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取，第二种适用于老组织的提取。

试剂：提取缓冲液，KAc(5M), 异丙醇，无水乙醇，DEPC水

仪器：离心机，恒温水浴锅，研钵

方法一 动物、植物（嫩叶）的总RNA分离

大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨

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加5mlTrizol裂解液

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12000rpm ，4度，10分钟

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加入1ml氯仿

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剧烈振荡15秒，室温温育2-3分钟

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室温离心10分钟，8000rpm

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取上清，加入等体积的异丙醇，15-30度放置10分钟。

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12000g离心10分钟

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弃上清，加入10ml75%洒精洗沉淀。

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2-8度下，不超过7500g离心5分钟

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弃上清，干燥沉淀10分钟

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用DEPC水溶。

方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离

1g组织液氮研磨，加入6ML提取缓冲液

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2min振荡

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65℃，20min

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加入1.5MLKAc

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混匀，冰浴20min

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8000rpm,4℃,15min

取上清，加入0.6倍异丙醇，-20℃，1小时（或室温15-20min）

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12000rpm,4℃,15min

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75%乙醇，12000rpm,20℃,5min

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晾干，溶60ulDEPC水，15min

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12000rpm,4℃,5min, 上清即为RNA。

提取RNA的关键步骤包括细胞破碎，RNA的分离和纯化。首先，需要破碎细胞膜和核膜，以释放细胞内的RNA分子。这可以通过使用细胞裂解缓冲液来破碎细胞。

接下来，使用酶（如蛋白酶）来消化蛋白质和DNA分子，以便只剩下RNA。

然后，使用酚/氯仿等有机溶剂来分离RNA。这些溶剂会与RNA结合，形成上层RNA溶液和下层DNA和蛋白质的混合溶液。

最后，通过沉淀和洗涤等步骤，可以从RNA溶液中纯化出纯度高且质量好的RNA。

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