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1. 分离纯化微生物的方法有哪些?各方法适用分离什么菌种?
2. 单细胞的分离方法有哪些
3. 标题单细胞分离和原生质体分离作用的酶解法有什么不同?
4. 单细胞测序应用及思路解析

1、分离纯化微生物的方法有哪些?各方法适用分离什么菌种?

筛选法 筛选法是一种常用的微生物分离纯化方法，它利用不同微生物的生理生化特性，通过对不同培养基的筛选，选择出目标微生物。这种方法适用于微生物数量较多的情况下，可以快速筛选出目标微生物。

纯种分离法 通过纯种分离，可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。

接种常见方法有：平板划线接种法、斜面接种法、倾注培养法、穿刺接种法、液体接种法。

最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

2、单细胞的分离方法有哪些

单个核细胞的比重与红细胞、白细胞及血小板不同，可通过密度梯度离心进行分离。T细胞表面有CD3分子，用CD3抗体包被免疫磁珠，T细胞与之结合，B细胞不能结合。细胞经孵育再通过磁场便能分离。

外周血单个核细胞的分离方法及由上到下的细胞分层是单次密度梯度离心分离法（Ficoll液），稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层、红细胞层。

分离单个细胞 早期的单细胞捕获方法包括显微移液法、显微操作法和激光捕获显微切割法[26-27]。与目前常用的几种方法相比，这些方法通量低，技术上具有挑战性，需要费时费力，但在需要分析的细胞数量较少（如稀有细胞）时仍可使用。

除去细胞膜和细胞壁后即可获得。原生质体分离的酶解法则旨在通过食管部位、胰蛋白酶等酶水解细胞膜和细胞壁，将细胞内的质体完整地分离出来。单细胞分离的酶解法帮助分离细胞，原生质体分离的酶解法则帮助提取完整的细胞质体。

单细胞挑取法 利用选择培养基分离法 纯化：若是你不知道你所要纯化的微生物的特征，最简单的不知道它的菌落特征和形态大小，那现根据你要分离菌的特性，找适合的初筛培养基，找到你要纯化的菌。

3、标题单细胞分离和原生质体分离作用的酶解法有什么不同?

用酶法分离原生质体可以采用以下两种不同的方法路线。两步法或顺序法：首先用离析酶或果胶酶处理组织使胞间层降解，把细胞分开再用纤维素酶处理这些游离的细胞，使原生质体释放出来。

随着生物酶技术的发展，普遍采用酶分离法来获得原生质体。常用酶制剂有果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶等酶制剂，通常复合酶的破壁的效果会比单酶的效果要好。

不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

酶解分离法：用酶（琼脂酶，果胶酶，纤维素酶等）将细胞壁分解。（条件温和，原生质体完整性好，活力高，得率高）因此原生质体制备多采用酶解法，此法操作过程分为：取材消毒，酶解制备，原生质体收集。

【答案】：（1）配制混合酶液。混合酶液包含具有解离细胞作用的果胶酶，降解细胞壁的纤维素酶、半纤维素酶和原生质体稳定剂。（2）将愈伤组织或悬浮细胞置入混合酶液中，温育一定时间后，即可游离出大量原生质体。

4、单细胞测序应用及思路解析

拟时序分析是指根据细胞之间表达模式的相似性对单细胞沿着轨迹进行排序，以此推断出发育过程中细胞的分化轨迹或细胞亚型的演化过程。

它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

单细胞测序技术已广泛应用于肿瘤方向的研究，但是受限于肿瘤细胞没有明确的Marker 基因，很难通过转录组数据从肿瘤细胞中区分正常和恶性肿瘤细胞。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。

单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。

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