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1. western blot 的内参不一致,急求助

1、western blot 的内参不一致,急求助

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。

第一，应该确认每个样品表达GAPDH的量一样，虽然是持家基因，本人觉得不同细菌可能表达量不一样，造成信号强弱不一样。可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异，调整上样量一样再检测GAPDH。第二，内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。

调整上样量，如果还是调不齐，建议做灰度扫描，将目的蛋白的灰度值比上对应的内参，这样比较准确，目前很多文章的western图都会附上相应的灰度扫描结果，这样更加定量和直观。

检测蛋白和内参分子量接近最好的办法就是更换内参 因为内参有好几种，分子量差别也比较大，更换分子量与检测蛋白差距更大的内参就可以避免这个问题 另外也可以先用一抗孵育显色和检测，再用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参的抗体孵育显色检测。

内参一般情况下的定义是正常样品中本来就有的相对更为稳定存在分子。 所以，你做好实验的“阳性对照”、“阴性对照”，然后保持与“试验处理样品”同样的样品上样量，再然后对pvdf膜进行剪切以及分别的抗体（内参抗体、目标蛋白的特异性抗体）孵育就可。

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