构建gus表达载体(构建表达载体用到的酶)
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1、求助关于GUS验证载体构建的一些问题
一般来说融合蛋白不影响gus的检测,不过影响不影响目的蛋白功能就不一定了。我个人倒是觉得,如果不做定位的的话,gus检测不是那么重要。可以把gus切下去(选用sacI位点)。pcr在基因组合转录组里面都能检测出来就认为目的基因正确表达了。要注意的是如果不融合的话别忘了CDS是要带终止密码子的。
我想这是因为你的启动子检测载体设计的不合理造成的,你可以在启动子前而加一个转录终止子,以阻止这种假阳性信号。还有一个原因是:如果是原核生物,启动子本来就只有几十甚至十几个bp,PCR检测不到很正常。
报告基因的主要作用是标记转化细胞,起报告和识别作用。常用的有Gus基因(β-葡萄糖苷酸酶基因),该基因来自大肠杆菌染色体上的uidA座位,编码β-葡萄糖苷酸酶。绝大多数植物不存在内源的Gus基因活性,因而Gus基因被广泛用作转基因植物的报告基因。
同样,Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游,以增强外源基因在单子叶植物中的表达。然而,有研究指出,特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序列等多种因素,甚至有时会取决于内含子在载体上的位置。
构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草,GUS组织化学染色显示该启动子 驱动基因在茎结节处特异表达,可能参与块茎形成过程。 研究在茎中特异表达基因的启动子,不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程,更重要的是利用这些启动子调 节植物代谢可满足人类需求,如人们对木质素生物合成及其调控的研究。
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