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1. DNA重组质粒载体中的快速克隆

1、DNA重组质粒载体中的快速克隆

在DNA重组质粒载体的克隆过程中，通常最耗时的步骤是外源DNA片段和质粒DNA区段的电泳纯化。S.Michaelis提供的优化方案通过简化步骤提高了效率。首先，消化外源DNA和载体DNA，使用适量限制酶，反应体积控制在20微升以内。在外源DNA片段上，若两端相同，还需进行磷酸化处理。

合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl，外源DNA与质粒载体的摩尔比应接近2：1。用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源DNA片段。

利用DNA重组技术在大肠杆菌细胞中克隆外源基因的基本过程通常包括以下步骤：DNA提取：从源生物体中提取所需的外源DNA片段，可以通过PCR扩增、酶切等方法获取特定的DNA序列。载体准备：选择适当的载体，常用的是质粒（plasmid）。质粒是环状的DNA分子，可以在细菌细胞中自主复制。

[操作步骤 操作步骤] 操作步骤 通过 PCR 方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因 序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为 BamHⅠ和 HiindⅢ） ，PCR 循环获得所需基因片段。

克隆过程：首先使用BamHI和EcoRI对含有目标DNA片段的PCR产物进行双酶切处理；同时对选择的质粒也进行相同的双酶切处理。然后使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中分别纯化回收线性化的目标DNA片段和线性质粒DNA。接着利用T4 DNA连接酶将纯化后的线性DNA片段与线性质粒连接起来，形成一个重组质粒。

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