构建cdna文库用哪种载体-构建cdna文库用哪种载体好
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- 构建cDNA文库时,比较好的载体是 A.质粒 B.入gt10 C.Ti质粒 D.BAC_百 ...
- cDNA文库的构建一般分为哪四步?
- cDNA组合载体,建立文库,最可能使用的载体是?
- 请教关于构建cdna文库载体的问题 我需要能将导入的基因表达为蛋白的表...
1、构建cDNA文库时,比较好的载体是 A.质粒 B.入gt10 C.Ti质粒 D.BAC_百 ...
质粒载体可用于生物cDNA文库构建。但只适合于高丰度的mRNA。(2). 噬菌体文库 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体很多,如单链的M13噬菌体载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、噬菌粒(phagemid或phasmid)等。
. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH6)溶液进行平衡,然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA;B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解;C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段;D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体);E 将重组体导入宿主细胞;F 最后筛选鉴定重组子克隆。
静置10min。6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。注: 静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。
如噬菌粒载体具有噬菌体的高效性和质粒载体系统可以利用蓝白斑筛选的便利;④cDNA的分子克隆:cDNA连入载体,转化重组体,扩增;⑤对构建的cDNA文库进行鉴定,测定文库包含的克隆数,评价文库质量。
2、cDNA文库的构建一般分为哪四步?
cDNA文库构建基本步骤:①制备mRNA:全RNA提取与mRNA的分离提纯;②合成cDNA:oligo dT与mRNA3’端poly(A)杂交作为引物合成第一链,第二链合成是以第一链为模板,DNA聚合酶催化。
cDNA与载体连接和导入宿主细胞:cDNA片段与载体DNA的连接就是在一定的条件下,由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5′-P与3′-OH之间形成磷酸二酯键的过程。
例如,cDNA文库是一种部分基因文库,它是在mRNA拼接过程中构建的,已经除去了内含子等成分,因此在DNA重组时更为方便。基因文库构建的步骤:提取基因组DNA:从待测生物样本中提取出基因组DNA是构建基因文库的第一步。
其基本步骤包括:(1)mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。(2)cDNA第一条链的合成。(3)cDNA第二条链的合成。(4)双链cDNA的修饰。(5)双链cDNA的分子克隆。(6)cDNA文库的扩增。
cDNA文库是一种包含了特定组织或细胞中所有mRNA的克隆集合。通过第一链合成,我们可以将mRNA转化为cDNA,然后将cDNA克隆到细菌中,构建出一个cDNA文库。这个文库可以用于筛选特定基因的表达模式,或者寻找新的基因和蛋白质。
3、cDNA组合载体,建立文库,最可能使用的载体是?
质粒plasmid:是存在于细菌 染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。
常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统;双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点,便于选择,灵活应用。
cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNA(cDNA)与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
在基因工程中,质粒被用作载体,将外源基因插入其中并转入宿主细胞中。通过将质粒与外源基因组合,可以方便地实现外源基因的克隆和表达。此外,质粒还可以被用作构建表达文库和cDNA文库的载体,以及用于制备基因治疗药物等。
4、请教关于构建cdna文库载体的问题 我需要能将导入的基因表达为蛋白的表...
载体应具备以下条件:带有复制子(DNA聚合酶识别位点)能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。
基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。其构建使目的基因能在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
当拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒。
拥有标记基因是为了方便质粒进入宿主细胞后容易被检测出来,以便检测目的基因是否导入受体。下面说说 载体所需的序列结构 目的基因就是能够产生所需蛋白质的DNA片段,比如抗虫棉就是植入能产生抗虫蛋白的目的基因。
载体构建目的 ①用它作为运载工具,将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。
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