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1. 原核重组表达载体的构建原理？

1、原核重组表达载体的构建原理？

回答如下：原核重组表达载体的构建原理是利用原核细胞（如大肠杆菌）的生物学特性，将目标基因（外源基因）插入到一个适合原核细胞复制和表达的载体DNA中，并通过转化等方法将这个重组载体引入到原核细胞中实现外源基因的表达。

具体步骤如下：

1. 选择适合的载体：选择一个合适的载体，常见的包括质粒（如pUC18、pBR322等）和噬菌体（如λ噬菌体）等。

2. 插入目标基因：将目标基因通过限制性内切酶切割，得到具有粘性末端的DNA片段。然后将目标基因片段与载体DNA进行连接，通常利用DNA连接酶如DNA连接酶I或T4 DNA连接酶进行连接。

3. 构建重组载体：将连接好的载体DNA转化到宿主细胞中，如大肠杆菌。转化可以通过热激、电穿孔、化学方法等实现。转化后，将细胞培养在适当的培养基上，利用选择性培养基筛选出含有重组载体的细胞。

4. 筛选重组细胞：通过选择性培养基中加入抗生素等物质，使得只有含有重组载体的细胞能够生存下来，从而筛选出重组细胞。

5. 验证重组细胞：通过PCR、酶切、测序等方法验证是否成功构建了重组载体，并确定目标基因的插入位置和方向。

6. 表达目标基因：经过验证的重组细胞在适当的条件下进行培养，使得目标基因能够在细胞内进行转录和翻译，从而实现目标基因的表达。

通过以上步骤，可以构建原核重组表达载体，实现外源基因的表达。

大体分为一下几步：

1.设计目的片段引物（含限制性酶切位点，要求：表达载体上有而目的片段上没有的酶切位点）

2.PCR扩增片段 3.扩增后的片段与pMD18/19T克隆载体连接，通过蓝白斑筛选，提质粒并酶切鉴定；将正确连接的克隆载体重组质粒酶切，回收目的片段 4.目的片段与表达载体连接 5.转化到DH5a等克隆菌株，通过抗生素筛选，鉴定表达重组质粒。

6.测序检测 7.正确的表达重组质粒再转到表达菌株 8.表达

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