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1. 酵母双杂交技术原理和步骤？

1、酵母双杂交技术原理和步骤？

酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于检测和分析蛋白质间的物理相互作用关系。其原理基于细菌酶活化剂Gal4的结构和功能。

以下是酵母双杂交技术的基本原理和步骤：

原理：

酵母细胞中的转录因子Gal4由两个部分组成：DNA结合域（DNA-binding domain, DBD）和激活域（activation domain, AD）。

用于检测蛋白质相互作用的目标蛋白（prey）与AD结合时，可激活报告基因的表达。

目标蛋白的相互作用伙伴（bait）与DBD结合时，带着AD一起靠近报告基因。

步骤：

(注意：以下步骤仅为简要介绍，具体实验步骤可能会根据实验需求有所不同)

a. 预处理：

选择一个包含Gal4 DNA结合域的酵母突变株作为宿主酵母菌。

构建两个质粒：一个质粒编码目标蛋白的DBD结合域（bait），另一个编码潜在互作蛋白的AD结合域（prey）。

将这两个质粒导入宿主酵母菌中。

b. 杂交实验：

在选择适当的培养基上进行酵母双杂交实验，带有特定筛选条件。

将转录报告基因（如LacZ、His3、或Ade2）的启动子与真核生物的基因启动子连接起来。

目标蛋白的DBD结合域与AD结合域一起通过形成蛋白复合物，相互接近转录报告基因，激活其表达。

根据报告基因的表达情况，判断目标蛋白与互作蛋白之间的相互作用关系。

c. 结果分析：

通过观察菌落形态、转色底物等方法对酵母菌进行初步筛选。

对筛选出的阳性克隆进行进一步验证，如荧光染色、Western blot、共沉淀等。

最终确认目标蛋白之间是否存在物理相互作用。

酵母双杂交技术原理：

建立真核生物转录激活因子的框架

利用GAL4捕获新蛋白质

试验流程：

构建诱饵质粒

将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合

共转化细胞

已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用

酵母双杂交系统技术步骤

1.

将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒;

2.

将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中,选择被转化的酵母;

3.

再将文库质粒转化到酵母中;

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