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1. 转染mirna inhibitor需要用rt-pcr检测吗
2. 如何构建miRNA的表达载体
3. mirna与靶基因互作实验验证方法?

1、转染mirna inhibitor需要用rt-pcr检测吗

暂时没有看到他们有内参和目标基因在同一反应管进行的miR PCR产品， 因为他们的PCR探针都用的同一种荧光。如果楼主感兴趣RT-PCR一步反应的，并且内参能够与目标miR在同一反应体系进行的产品，还要去咨询各大厂商。

在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

不只是更稳定，表达时间长这么简单，可以实现细胞实验，不需要转染试剂，另外，可以直接溶解后用于动物实验。总之，结构与使用方式与mimics有不同，但作用是一样的，都是使得内源性的miRNA上调。

2、如何构建miRNA的表达载体

双荧光素酶报告基因系统：该方法通过构建含有miRNA靶标位点的Luciferase报告基因载体，并将其转染至细胞中，然后共转染miRNA和Luciferase报告基因载体。

对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。

将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。

载体形式的miRNA inhibitor，采用的方法如miRNA sponge法，这也是目前SCI文献中用的较多的一种方法。 作用方式 microRNA-RISC对靶基因mRNA的作用主要取决于它与靶基因转录体序列互补的程度，有三种方式。

我们在玉米（Zea）RNA载体背景中加入合成的成熟miRNA（IDT）来验证。就northern来说，每个miRNA家族成员的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE胶上进行。优化杂交温度，让LNA探针只与目的miRNA结合，而不与其它成员结合。

3、mirna与靶基因互作实验验证方法?

miRNA靶位点鉴定：目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。

选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。

用一些预测软件，例如TargetScan、miRDB等。可以同时使用几个软件预测，挑选出重叠的靶标，进行靶标验证。一般预测的靶标都是3；UTR区有结合位点，因此通常使用双荧光素酶报告实验来证明是否真的是直接靶标。

然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。

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