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1. pcr引物序列如何确定？

1、pcr引物序列如何确定？

1. 引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性;

　　2. 引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应;

　　3. 引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行;

　　4. 引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大;

　　5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G C) 2(A T);

　　6. 引物5#39;端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

　　7. 引物3’端不可修饰。引物3#39;端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3#39;端使用碱基A。

　　8. 引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加;

　　9. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3#39;端G值较低(绝对值不超过9)，而5’端和中间G值相对较高的引物。引物的3’端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应;

PCR引物序列的确定需要遵循一些准则：

使用与扩增产物相同的鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C）含量（最好是50%）。

避免引物中的二级结构，特别是在3′端。

使用相互之间不互补的引物。

使用长度在20到30个碱基之间的引物（或更长）。

熔解温度（Tm）为58至70 ℃。

3′端的五个核苷酸应不超过两个G和/或C碱基。

扩增PCR的引物除了通用引物，如16S，18S之外，都是要自己设计的，要根据你要扩增的基因设计一对引物

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