大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于真核表达载体构建总不长菌的问题，于是小编就整理了4个相关介绍真核表达载体构建总不长菌的解答，让我们一起看看吧。

1. 求助!刚刚开始做分子实验,但是转化的时候老不长菌,求大神帮我分析一下...
2. 为什么构建的表达质粒在bl21中长不起来
3. 同源重组不长菌的原因
4. 敲除电转化后菌落很小长不大

1、求助!刚刚开始做分子实验,但是转化的时候老不长菌,求大神帮我分析一下...

经供参考：转化未成功；感受态有问题（如果感受态有问题可以用无抗性的培养基多对照涂平板）。

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年，英国科学家格里菲思（F．Grifith，1877—1941），通过实验推想，已杀死的S型细菌中，含有某种“转化因子”，使R型细菌转化为S型细菌。

转化细胞（转化子）：带有异源 DNA 分子的受体细胞（ Transformant ）。 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。

2、为什么构建的表达质粒在bl21中长不起来

先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。

感受态太久了；抗生素的浓度过高；大部分为假阳性；主要还是挑单菌落做个菌液PCR，这样才能初步确定质粒有没有转进去，菌落形态只能做个大致分析。

可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是不是融解性太差，建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。

转化成功的E.coli细胞会带有Kana抗性，不怕Kana，没转化成功的无法在含有Kana的琼脂板子上生长。不需要蓝白斑，就挑取能在上面生长的菌落就可以了，那些都是已经成功转化、带有质粒的菌。

构建载体时，转化过后不长菌的原因：转化的时候有误，可以重新实验。

3、同源重组不长菌的原因

不长菌可能有以下几个问题：1）引物设计不正确：引物须按照产品说明书要求设计，由两部分组成：重叠区域（即同源臂） 特异性引物。重叠区域的Tm值尽量一致且60℃。

原因有同源片段长度不够和同源片段中存在大量的不同序列。同源重组的效率和同源片段的长度成正比，同源片段长度不足，会导致同源重组效率低下。同源重组时，同源片段中存在的序列差异越大，重组效率就越低。

【答案】：F质粒整合进入细菌基因组产生Hfr菌，F质粒通过其IS序列与基因组中的IS位点进行同源重组，由于细菌基因组中有多个不同的IS位点，因此F质粒可整合在不同位置，产生不同的Hfr菌。

那就要看是什么菌种的，有些菌种是重组酶缺陷的，比如TOPstbl3等等，有些菌种表达重组酶，只要有同源序列，就容易发生重组。你要好好看看菌种的说明书，看看是不是重组缺陷的。

4、敲除电转化后菌落很小长不大

菌落密度低：在制备电转板时，如果将目标细胞的菌落密度调得过低，那么在电转后板子上长出的菌落数量也会很少。

分子克隆，转化后如果是过夜就取出来的平板，菌落可能不会长得很大。主要还是要看放置一段时间后，菌落形态是否有变化（可以在37C继续培养，如果怕长过了，也可以放在室温下）。

一个细菌会成为一个菌落，这些小的是原来沾上的一个个细菌生长成的，有可能是接种时飘落的芽孢，或是培养皿中有细菌意外飞出了，反正这些是不可能消除的，实验总会有误差。

原因有：细菌密度过高，平板培养基配制不当。细菌密度过高：如果菌液中的细菌密度过高，就会在平板上形成密密麻麻的小菌落。

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