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1. CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)构建sgRNA Cas9载体
2. 如何利用crisp进行基因编辑
3. 精准大海捞针--CRISPR screening专题
4. CRISPR-Cas9基因编辑不只是剪开DNA这么简单

1、CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)构建sgRNA Cas9载体

利用 CRISPR/Cas9 进行基因的编辑，首先要构建有效的 sgRNA。一般地，基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序。

怎么样才能通过尽量少的sgNRA数量，去敲除尽量多的TP53蛋白。既然是做knockout，那一定是要所有的亚型都不能表达。

文库构建：针对某个物种，每个基因设计3个或以上的sgRNA，高通量合成sgRNA，然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒载体中。

2、如何利用crisp进行基因编辑

cas9基因编辑原理：将CRISPR/Cas系统嵌入到基因组中，使CRISPR核酸和Cas蛋白能够结合到特定的DNA序列上，从而实现基因编辑的目的。CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。

近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。

重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。

从而造成基因的改变，而DNA修复有homology-directed repair （HDR，有模板，可用单链ssODNs和双链DNA）和nonhomologous end joining （NHEJ），从而达到基因编辑的效果。因此，CRISPR是开头，而DNA repair则是最后的关键。

这样一条完整的gRNA就可以识别靶点，并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点，引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断，从而达到基因编辑的目的。

3、精准大海捞针--CRISPR screening专题

在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。

对CRISPR筛选得到的候选基因进行富集分析以了解基因的更多功能，同时也可以对CRISPR筛选结果进行验证，以便对潜在候选基因开展进一步研究。

深耕针对这些分子作用机制的精准医学，通过人工智能、蛋白工程等方法发现创造药物、构建纳米机器、打造分子工厂，从而为建设“健康中国”、促进人类健康做出贡献。

4、CRISPR-Cas9基因编辑不只是剪开DNA这么简单

而对于依赖模板的HDR介导的CRISPR-Cas9编辑方法，则检测方法要更加复杂一些。

cas9基因编辑原理：将CRISPR/Cas系统嵌入到基因组中，使CRISPR核酸和Cas蛋白能够结合到特定的DNA序列上，从而实现基因编辑的目的。CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR-Cas9的广泛应用：基因敲除（Knock-out）Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。

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