1.  > 载体构建

构建shRNA的慢病毒载体-慢病毒构建步骤

构建shRNA的慢病毒载体-慢病毒构建步骤

大家好,今天小编关注到一个比较有意思的话题,就是关于构建shRNA的慢病毒载体的问题,于是小编就整理了5个相关介绍构建shRNA的慢病毒载体的解答,让我们一起看看吧。

  1. shRNA实验步骤
  2. 什么是慢病毒包装
  3. 如何快速设计shRNA
  4. shRNA慢病毒载体合成步骤
  5. 采用慢病毒载体构建shRNA载体有什么优势?

1、shRNA实验步骤

rna的选择:需要根据研究对象的需要,选择适合的RNA探针(如siRNA、shRNA、miRNA、lncRNA等)。rna标记:为了方便后续检测和定位RNA分子,可以使用荧光标记、生物素标记或其他标记化方法对RNA分子进行标记化处理。

设计具有两端反向重复序列的片段,插入表达载体内即可。目前有构建shRNA的试剂盒出售的。

先用iso-type control,也就是非特异性的同型抗体染的细胞测,设好了阴性的阈值。 再用特异性抗体测用对照序列shRNA转染的细胞,看阳性细胞的比率 再测用shRNA转染的实验组的细胞,看阳性细胞的比率。

简单来说,Off-target效应就是指干扰shRNA序列进入了microRNA途径,通过microRNA途径,其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。

2、什么是慢病毒包装

病毒包装的原理,就是有遗传物质有外壳蛋白,在细胞内可以指导二者包成病毒。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

慢病毒包装简要流程:1)含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。2)慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3)培养48hrs-72hrs左右,收集含有病毒的上清培养液。4)病毒的纯化和浓缩。

慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

病毒包装,是一种基因诊断、基因治疗技术。主要是将外源基因DNA或RNA片段导入靶细胞或组织,研究靶基因的上调或抑制情况。

3、如何快速设计shRNA

ShRNA 的设计原则 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列,中间由一茎环序列分隔的,组成发夹结构,由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5~6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。

设计具有两端反向重复序列的片段,插入表达载体内即可。目前有构建shRNA的试剂盒出售的。

引物不跨外显子设计也可以,但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因组,你实验的时候可以做一个NRT的对照看一下有没有基因组污染。

在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C,使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

4、shRNA慢病毒载体合成步骤

准备六孔板一个孔细胞,吸去细胞培养液,加入混匀了的病毒转染液(950μL培养基 50μL浓缩病毒 1μL 1000×Polybrene),37℃,5% CO2培养箱中培养。12h后,更换回普通培养基。

将actin基因,放入慢病毒融合表达载体,与荧光蛋白(GFP)融合表达,注意避免移码突变。然后将重组质粒以及辅助质粒共转染细胞,可以用脂质体法,慢病毒配套细胞一般为293。收集慢病毒,浓缩。用慢病毒转染原代细胞。

将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中,进行双酶切和测序鉴定。结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。

慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因(蛋白质编码序列、shRNA或gRNA)导入动物和人的原代细胞或细胞系。

5、采用慢病毒载体构建shRNA载体有什么优势?

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。

右图为shRNA真核表达载体pYrbio-LT-1质粒图谱选用原装进口shRNA表达系统,具有:优点:(1)原装进口产品,未做任何改动。(2)装载shRNA序列的真核表达载体,同时也是慢病毒包装系统中的穿梭载体,可用以包装慢病毒。

慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因(蛋白质编码序列、shRNA或gRNA)导入动物和人的原代细胞或细胞系。

两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA(siRNA)和基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA和shRNA都可用于蛋白沉默,但它们的作用机制有所不同。

关于构建shRNA的慢病毒载体和慢病毒构建步骤的介绍到此就结束了,不知道你从中找到你需要的信息了吗 ?如果你还想了解更多这方面的信息,记得收藏关注本站。 构建shRNA的慢病毒载体的介绍就聊到这里吧,感谢你花时间阅读本站内容,更多关于慢病毒构建步骤、构建shRNA的慢病毒载体的信息别忘了在本站进行查找喔。

[免责声明]本文来源于网络,不代表本站立场,如转载内容涉及版权等问题,请联系邮箱:3801085100#qq.com,#换成@即可,我们会予以删除相关文章,保证您的权利。 转载请注明出处:http://www.mxzdyx.cnhttp://www.mxzdyx.cn/zbpj/2158.html