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1. 鲫鱼的荧光素酶的大小?还有鲫鱼荧光素酶融合载体的构建步骤。
2. 哪位同学可以介绍下Luciferase 原理
3. 荧光素酶报告基因检测
4. 双荧光素酶质粒共转染怎么做?
5. 请教luciferase 的 具体操作PROTOCOL

1、鲫鱼的荧光素酶的大小?还有鲫鱼荧光素酶融合载体的构建步骤。

用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。

构建负责表达荧光素酶的载体：在实验中，通常将感兴趣的基因调控区域与荧光素酶基因关联起来，构建成双荧光素酶报告基因的表达载体。这个基因构建过程通常通过分子克隆技术来完成。

杂环荧光素首先腺苷化，然后通过氧化脱羧作用，产生AMP、CO2，并通过激活的荧光素中间产物发射光。

常用的载体有两种策略。第一种是两种荧光素分别位于两个载体上，第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。以第一种为例，这两种载体分别为pMIR-REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。

2、哪位同学可以介绍下Luciferase 原理

其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。

Luciferase报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence）。

双荧光素酶报告基因实验原理是利用双荧光素酶作为荧光素酶的标记来研究基因表达与调控的机制。

双荧光素酶实验原理：利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。

3、荧光素酶报告基因检测

构建负责表达荧光素酶的载体：在实验中，通常将感兴趣的基因调控区域与荧光素酶基因关联起来，构建成双荧光素酶报告基因的表达载体。这个基因构建过程通常通过分子克隆技术来完成。

用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。

Luciferase报告基因系统是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence）。

其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。

Luciferase报告基因系统是以 荧光素（luciferin） 为底物来检测 萤火虫荧光素酶 （fireflyluciferase）活性的实验。荧光素底物会在荧光素酶作用下会发光（波长540-600nm），且光强能反应荧光素酶的表达量。

4、双荧光素酶质粒共转染怎么做?

用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。

稳定转染株可以通过将转染质粒含有目标基因和报告基因的载体与细胞进行共转染，然后使用选择性抗生素对转染细胞进行筛选和培养，最终获得稳定表达目标基因和报告基因的细胞株。所以双荧光素酶报告基因实验可以用稳转株。

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。

验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。验证microRNA同lncRNA靶向互作。

构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。

5、请教luciferase 的 具体操作PROTOCOL

24 孔板每孔加入100-150μl 1X PLB裂解缓冲液以覆盖细胞，然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。

一般构建luciferase载体的时候是把待研究的基因装在luciferase基因的前面，从而以luciferase的表达来了解目的基因的表达情况。

Firefly luciferase和Renilla luciferase被称为报告基因，是因为在表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可监控微观层面上的分子间相互作用。

影响荧光酶活性的因素很多，温度，PH值，培养基里的酚红含量，注意荧光素必须要避光保存，否则发光减弱。

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