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1. 慢病毒转染过表达组病毒浓度是多少
2. 10mm皿转染质粒的量
3. 慢病毒转染荧光不是100%
4. 质粒转染和病毒感染

1、慢病毒转染过表达组病毒浓度是多少

设置不同MOI值的感染组，通常设立1，2，5，10，20，50，100的感染组别，各做两个孔，一个孔中加入终浓度为5 μg/ml的polybrene，另一组不加。Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染，但在少数情况下它对细胞有伤害。

将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。

慢病毒感染细胞后需要4天的时间才能观察到慢病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度20~40%时且细胞状态良好时加入慢病毒，确保在感染后4天时细胞增长达到90% ～100%的汇合度。

因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞武鸣县毒性反应为最佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度6-8ug/ml。

2、10mm皿转染质粒的量

一般建议使用最终浓度在0.5-5μg/ml之间。轻轻摇晃培养皿，使细胞和转染试剂充分混合，然后将培养皿放回到37℃的细胞培养箱中进行培养，一般建议培养6-48小时。在转染后适当的时间收集细胞，进行下一步实验。

个质粒的要求如下所述：对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为 3：1 或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。

小提质粒浓度较低，一般仅为0.1~0.2ug/ul。而用质粒转染细胞，一般至少需要2~5ug左右，如果使用小提质粒，只能加大上样量，这样对转染操作会有一定影响。

大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般5-5ml。

实验四 转染 （1） 胰酶消化细胞并计数，接种至100mm培养皿中，使其在转染日密度为60%-70。底面积为100 mm的细胞培养皿，每个皿内最大容量加入20μg质粒DNA，用5 mL无血清培养基稀释，混合在室温下放置5 min。

3、慢病毒转染荧光不是100%

针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

感染前一天接种，使得第二天细胞汇合度为30-40%。培养板可以是96孔板（只通过显微镜观察荧光）或是24孔板（通过流式或是定量PCR确定感染比例）。

细胞转染后观察荧光结果：1）转染细胞状态一定要好，这是成败的关键。

慢病毒细胞转染技术存在成本较高，病毒在制备过程中需要极其严格的洁净度和纯度。

一般认为，在转染后的第24~48 h之间，是慢病毒的生产高峰，这时病毒产生速率高于降解速率。可以在这个时间收获第一批慢病毒，此时也是滴度最高的时候。

4、质粒转染和病毒感染

质粒转染和病毒感染异同：（1）质粒转染：相对简单的基因传递方式，与病毒载体主动进行细胞攻击侵染方式不同，质粒转染属于被动扩散。

两者在本质上并没有区别。无论是质粒转染，还是病毒转染，均是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。

侧重点不同 （1）转化：转化进入受体细胞的则是染色体DNA的片断或质粒DNA。（2）感染：转染过程中进入细胞的是完整的病毒DNA。（3）转导：一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。

目前，流感病毒的重新合成主要通过用8-12个质粒共转染细胞来实现。其中，8质粒系统拯救甲型流感病毒最为广泛。

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