载体构建验证失败（载体构建失败原因）

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测序结果紊乱，你这个描述不具体啊。是测序完全失败，重复序列后双峰，信号衰减，或者别的情况啊。

酶切鉴定需要培养大肠杆菌，抽提质粒后才能进行。缺点是耗时，优点是结果可靠。菌落PCR只需用接种针或小枪头蘸一下菌落或菌液，再接入PCR体系中，通过PCR即可判断目标条带的存在。优点是获得结果快，缺点是可能有假阳性。

测序一般900~1000以后就不准了，不可信，你看下峰图就知道了，都乱的。

酶应该是够的，如果怕，就多加一点。但问题是如何保证他们能够把所有的两个AB位点都切开，如果切不开。那你的片断就多了一截。所以建议最后测序验证你的clones。

首先分析测序结果是否正确，融合表达有没有同框，其次分析是没有表达还是表达较弱，可以采用Western检测目标蛋白或者检测标签，如果是弱表达的话就需要优化表达条件。

把提到的质粒，双酶切，跑胶，看看是不是2条带，1条200多，1条5000多。如果是，就没问题，不用纠结了。如果不是，那你的质粒有问题。

我个人倒是觉得，如果不做定位的的话，gus检测不是那么重要。可以把gus切下去（选用sacI位点）。pcr在基因组合转录组里面都能检测出来就认为目的基因正确表达了。

首先得判断蛋白条带是否正确，因为32a表达过程中，会在目标蛋白上加上部分自己序列，所以电泳图谱中你所要表达的蛋白，应该比你自己预期的大20-30kDa。

一般来说融合蛋白不影响gus的检测，不过影响不影响目的蛋白功能就不一定了。我个人倒是觉得，如果不做定位的的话，gus检测不是那么重要。可以把gus切下去（选用sacI位点）。

双酶切质粒或的一条带很正常的，因为多克隆区域切下来的那个小片段太少（总碱基mol量），电泳常常是看不到的，这是常见现象。一条带都没有不正常。估计是电泳时间不够吧。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

第一个办法，如果你有这个载体的通用引物，可以用这俩通用引物做pcr，然后电泳观察条带的大小，如果条带和你的mrna的大小相近（应该是略大于mrna的，因为带有了小部分的载体序列），那就说明这里边是插入目的基因的。

这一般不容易发生，有的人喜欢用柱子纯化PCR产物，我则习惯跑胶后纯化，这样PCR产物和引物等已经完全分离，则不会发生这种情况。

这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。

菌液PCR有风险，因为PCR是有一个级联放大的效应在里面，只要在菌液中沾了一点转化时用的核酸片段，就有可能会扩增出来。

转入基因被内源性切割酶破坏，导致无法正常表达。转入位点的内环境导致转基因的表达效率大大降低甚至无法正常表达。转入基因的拷贝量过少，或者说是含量过少。

目的基因是否表达与基因上的调控序列有关。很有可能是因为启动子出了问题，需要修饰之类的。

原因分析：1）引物特异性不好，不能有效扩增目的片段。

基因表达载体上面有基因表达需要的部件，例如35S启动子等等。如果连接反了，当然就不能表达了。

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