大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于载体构建未获得克隆的原因的问题，于是小编就整理了5个相关介绍载体构建未获得克隆的原因的解答，让我们一起看看吧。

1. 原核表达 表达载体构建以后为什么筛选不出阳性克隆
2. 构建TA克隆,为什么测序结果老是空载体
3. YAC克隆载体常出现哪些问题?
4. 无缝克隆试剂盒常见问题与处理办法
5. 请教载体构建的问题!

1、原核表达 表达载体构建以后为什么筛选不出阳性克隆

表达实现方式不同：原核表达载体测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

目的片段的获得 根据已知序列设计带酶切位点的基因引物，扩增得到该基因序列。连接 将目的片段和原核表达载体分别酶切处理，回收酶切片段。通过连接酶连接。转化 讲构建好的表达载体转化细菌，涂布在特定抗性的平板上。

质粒的检测因质粒性质不同而不同，一般人工质粒有抗性基因，可以通过抗性筛选而大致判断。最经典的质粒确认是质粒DNA提取（不含有宿主DNA的）之后进行电泳确认其大小（3条带）。还可以通过质粒上特殊序列的PCR扩增而确认。

一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

2、构建TA克隆,为什么测序结果老是空载体

dna测序过程，其实是pcr的过程，你只要有足够的模板用于pcr反应就行，不一定要克隆到载体上。

实验过程中遇到这种问题，通常有两种情况：（1）目的基因未连上去，测序时测的是空载体；（2）挑菌的时候没挑到单克隆，菌落由空载体和连接成功的载体共同组成，测序时测到了空载体。

如果是克隆，连接T载体后不用酶切，直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。

明显是没重组上嘛。你应该酶切鉴定，跑电泳看看。如果能酶切出目的条带，那一般就没问题 了，再送公司去测序。你连接反应的目的基因和载体要酶切时间长，保证切干净。酶切回收后的载体和目的基因的浓度保证比较高。

3、YAC克隆载体常出现哪些问题?

YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。（3）YAC还有缺失现象，影响YAC文库的代表性。

YAC载体的缺陷是在YAC载体的插入片段中会出现缺失和基因重排的现象，容易形成嵌合体，与宿主细胞的染色体大小相近，很难分离。YAC的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的容忍性。

有些克隆不稳定。（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。应用领域在染色体区带构建YAC重叠群，可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。 细菌人工染色体（BAC）是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。

克隆技术应用于人体将导致对后代遗传性状的人工控制。克隆技术引起争论的核心就是能否允许对发育初期的人类胚胎进行遗传操作。这是很多伦理学家所不能接受的。

生物进化令科学家产生的五大困惑是哪些 2001年，RGP为了克服YAC克隆的局限性，又以PAC为载体构建了水稻Nipponbare基因组文库，此文库由72000个Sau3AⅠ酶切克隆组成，平均插入片段长120kb，覆盖水稻基因组的16倍。

4、无缝克隆试剂盒常见问题与处理办法

目标区域选择：首先，通过人工或计算机自动化算法，选择要进行无缝克隆的目标区域，并提取出该区域的图像信息。区域对齐：将目标区域与目标图像的指定位置进行对齐，使它们在图像坐标系统中正确对应。

无缝克隆反向设计引物方法如下：线性化目的载体：用酶切或是PCR方式；PCR获取目的片段。

样品处理不当。（6）Mg2 浓度偏高，因适当调整Mg2 使用浓度。（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpressII 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 ExnaseII。

5、请教载体构建的问题!

PCR是否成功？如果跑胶后目的片段的条带位置正确，可基本确定成功。胶回收是否成功？胶回收后是否跑胶查看浓度？SmaI酶切体系是否正确？通常酶量不能超过体系1/10，否则甘油会妨碍酶切的进行。

先回答你的问题，转入外源基因的农杆菌不能较载体，它本身是外源基因的受体，携带外源基因的质粒或者噬菌体才是载体。你想问基因表达载体的构建，这个问题太大，而且表达载体多种多样，用处也很多，所以很难一下子概况。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

选择合适的载体：要根据不同的实验需求选择不同的载体，比如选择质粒、病毒、合成RNA等。选择载体需要考虑载体大小、复制能力、选择标记、特异性表达等因素。

到此，以上就是小编对于载体构建未获得克隆的原因的问题就介绍到这了，希望介绍关于载体构建未获得克隆的原因的5点解答对大家有用。