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1. 导入载体之后的目的片段与原片段发生两个碱基的差异,是什么原因_百度知 ...
2. LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计
3. 载体构建系列疑问。。、。

1、导入载体之后的目的片段与原片段发生两个碱基的差异,是什么原因_百度知 ...

构建表达载体时目的片段可以携带utr区的碱基首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。

有可能是在PCR扩增目的片段时，由于未采用高保真DNA聚合酶，导致的碱基突变。也可能是PCR扩增目的片段时，设计的引物特异性不高，或反应体系及参数对特异性控制的不好，获得的是非目的条带。

这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。

后随链合成的不连续冈崎片段用DNA连接酶连接复制到达复制终止序列，在终止蛋白作用下终止复制。

这样损伤就限制在原来的链上，不至影响到新合成的DNA。在一个具有切除修复缺陷的E.coli中，RecA基因的突变使其失去所有的修复能力，人们试图在Uvr-/RecA-的细胞中进行复制产生一段DNA片段，预期其长度是在两个TT之间。

2、LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计

构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。

第一次PCR：F R1 cDNA→A，F1 R cDNA→B；因为F和R端是全长的两端。因此需要设计出所需要的酶切位点 ，这个可以根据自己的载体来确定。

下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达，分别采用T/A克隆，传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。（1） T/A克隆 T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法（图15）。

3、载体构建系列疑问。。、。

构建载体时，转化过后不长菌的原因：转化的时候有误，可以重新实验。

SmaI酶切体系是否正确？通常酶量不能超过体系1/10，否则甘油会妨碍酶切的进行。

可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是不是融解性太差，建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。

每个基因都带有启动子和终止子。提取的目的基因本身就带有启动子和终止子，如果是通过逆转录方法合成的目的基因，就要先人工加上启动子和终止子，再进行扩增。

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