大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于载体构建后菌落pcr做不出来的问题，于是小编就整理了4个相关介绍载体构建后菌落pcr做不出来的解答，让我们一起看看吧。

1. 为什么基因链接好做完转化之后长出来的菌落做PCR验证没有结果呢,扩增不...
2. 菌落pcr跑不出来
3. ...子载体遇到了困难,总出现假阳性的克隆,菌液PCR检测不到目的片段却...
4. 请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来

1、为什么基因链接好做完转化之后长出来的菌落做PCR验证没有结果呢,扩增不...

如果你确认 “转化后挑取含有目的片段的单菌落”这个步骤正确的话，就是你的PCR出问题了么，继续扩增便可。目的片段与载体脱离还是保留的菌种失活？ 应该都不会。

而PCR扩增对模板的量也是有一个比较合适范围的，你可以分别用师兄师姐给的确定能P出来的质粒和基因组DNA，按照他们的经验给的最适模板量，在最适模板量上下设置一个梯度范围去扩增，找到自己认为的最适模板浓度。

细胞都不知道杀死没 ：rol：一般大肠杆菌用菌液PCR都很不稳定的 你想P的基因不会在基因组里吧？就算在质粒里也不一定能P出来 何况基因组。

菌落pcr的假阳性很多，也有很多原因，所以一般都是需要测序结果佐证的。1，引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。

菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大，我们实验室一般对于高拷贝数的质粒，循环数不会超过25个，一般用25个。

2、菌落pcr跑不出来

可能是因为你的DNA产物与酶进行结合了，导致堵在胶孔里跑不下来，你可以加一点SDS然后再跑胶图，就可以分开了，就不会堵在胶孔里了。

你这个方案存在3个可能的问题：PCR体系有问题；磁珠拉菌拉不下来；磁珠会破坏PCR体系。个人感觉应该不会是磁珠，毕竟通过离心或者磁铁吸引的方式可以很轻松的分离磁珠，而且机制来说也说不清楚。

原因有PCR体系问题、引物问题、模板质量问题。PCR体系问题：检查PCR体系有没有问题，也就是试剂有没有问题，比如扩其他的基因能不能扩出来。

因为在紫外灯下可以看到明显的后移条带。我是扩增16srDNA我们实验室以前都是用菌落PCR的，能扩增出来，可我就是扩不出来，郁闷！老大，再给指教指教吧！王会征（站内联系TA）建议提质粒进行PCR，菌落PCR很不准的。

3、...子载体遇到了困难,总出现假阳性的克隆,菌液PCR检测不到目的片段却...

我想这是因为你的启动子检测载体设计的不合理造成的，你可以在启动子前而加一个转录终止子，以阻止这种假阳性信号。还有一个原因是：如果是原核生物，启动子本来就只有几十甚至十几个bp，PCR检测不到很正常。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

如果positive control有条带，但是你的目的条带没有，就说明你的克隆都是阴性的。你体系中加DMSO，是因为目的片段的GC含量较高吗？这种片段本身就比较难扩增。

如果PCR系统没有问题，很可能是质粒和染色体发生了重组。建议提细菌的genome DNA 做一次PCR。如果是阳性，就说明是这样。另外，还可以另挑几个菌落，重新提质粒扩增。

4、请教各位前辈 为什么我做菌落PCR总也P不出来

此外，检查你的平板是不是太长时间了，抗生素失效？会造成质粒丢失，自然p不出来。

新划板革兰氏阴性菌一般PCR是可以P出条带的，不过挑菌体挑多了也会P不出来！天龙n部（站内联系TA）我们好像很好P啊，你不会没连上目的基因吧丰之第（站内联系TA）你可能是把培养基挑在里面了。建议先处理，后pcr。

菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大，我们实验室一般对于高拷贝数的质粒，循环数不会超过25个，一般用25个。

你用菌斑跑PCR是能跑出，很可能因为转化农杆菌用的质粒较多，使得培养基和细菌表面都有很多没转进去的目的质粒，可以作为模板，扩出目的带，而用菌液时，细菌表面的质粒已被稀释了很多倍，所以P不出来，或者带很弱。

到此，以上就是小编对于载体构建后菌落pcr做不出来的问题就介绍到这了，希望介绍关于载体构建后菌落pcr做不出来的4点解答对大家有用。