大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于构建rnai慢病毒载体的问题，于是小编就整理了3个相关介绍构建rnai慢病毒载体的解答，让我们一起看看吧。

1. 慢病毒感染技术原理
2. 如何快速设计shRNA
3. ...利用RNAi技术研究该基因的功能?RNAi载体怎么构建?

1、慢病毒感染技术原理

并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。在研究RNAi方面，慢病毒技术是最为有效的一种解决方案。

利用HIV病毒将自身基因组插入整合到宿主基因组的特性。在293T细胞内先转染三个质粒，分别为HIV病毒合成所需要的组分（改造过的），其中一个带有装配入病毒衣壳信号序列的质粒上插入要稳转的序列。

Polypene 的选择：Polypene 是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polypene 能提高感染效率2～10倍。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

慢病毒是一种慢性疾病，感染后可导致机体免疫系统受损，从而使病毒在体内持续繁殖和扩散。病毒感染后，机体产生的抗体和免疫细胞不能完全清除病毒，导致病毒在体内长期存在，从而引起颗粒聚集。

2、如何快速设计shRNA

ShRNA 的设计原则 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5～6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。

设计具有两端反向重复序列的片段，插入表达载体内即可。目前有构建shRNA的试剂盒出售的。

引物不跨外显子设计也可以，但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因组，你实验的时候可以做一个NRT的对照看一下有没有基因组污染。

在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中，进行双酶切和测序鉴定。结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中，测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。

3、...利用RNAi技术研究该基因的功能?RNAi载体怎么构建?

“酶切-连接”方法是通常构建RNA干扰载体最常用的方法，被广泛应用于各种生物之中。其构建过程是：通过PCR方法得到目的基因的片段（添加了合适的酶切位点），使之正反相连形成顺式片段和反式片段。

RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，RNAi发展迅速，已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志评为2002年度的十大科技突破。

rnai技术的基本程序主要为：确定干扰靶点、合成siRNA、转染siRNA到细胞中。确定干扰靶点：通过基因组学凳厅袜、转录组学等手段，确定需要干扰的靶基因或RNA。

RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

在水稻中利用RNAi技术来验证定位的基因 。如根据定位的矮秆或多蘖基因所在的BAC设计引物 ，获得小片段cDNA ，再将其连到载体中通过农杆菌介导法导入正常的植物体内 ，让其在植物体内表达 。

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