PET系列载体构建-pet28a载体构建的方法

大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于PET系列载体构建的问题，于是小编就整理了5个相关介绍PET系列载体构建的解答，让我们一起看看吧。

需要，作为运载体需要具备的条件就是含有启动子，标记基因，终止子，目的基因插入运载体后，细胞翻译蛋白质是利用运载体本身的启动子，终止子。如果不去掉就法翻译完全。而且，目的基因本身就不包含终止子。

以前合过相应的引物，是针对pET30a的，5；端用的是BamH1，3；端用的是Xho1 现在要更换载体用pET28a。要插入的基因长度是684bp。

我最后重做了，重新设计引物，重新TA克隆和连接表达载体了，很快呀，就一个周，就出来了。做不出来你可以一边找原因，一边重做。

如果没有弄错，那就需要改动连接体系，载体和片段的数量比在1：5-1：10之间，片段越小就多加点。还有一个就是感受态效率，做连接的感受态效率要在10^6以上。

连接片段上设计reverse primer，这样就可以排除假阳性了。重做一次克隆也快，你小心点，重头来遍就可以了，不用急，载体回收好，排除质粒污染，少酶切点，载体一点点就够了，时间长点，NEB的3h，一般的酶酶切过夜。

在pET表达载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶的调控，目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，在加入T7RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。

一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21 DE3中，通过IPTG诱导进行表达。通过扩大培养的体积获得更多的代谢产物。

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。

pET系列载体都用来自于λ 噬菌体的T7启动子，该启动子转录需要用到T7 RNA聚合酶。而野生的大肠杆菌（比方说DH5α或BL21）体内没有该酶的基因，所以无法启动该启动子后面基因的表达。

通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。

一般来说融合蛋白不影响gus的检测，不过影响不影响目的蛋白功能就不一定了。我个人倒是觉得，如果不做定位的的话，gus检测不是那么重要。可以把gus切下去（选用sacI位点）。

首先分析测序结果是否正确，融合表达有没有同框，其次分析是没有表达还是表达较弱，可以采用Western检测目标蛋白或者检测标签，如果是弱表达的话就需要优化表达条件。

首先得判断蛋白条带是否正确，因为32a表达过程中，会在目标蛋白上加上部分自己序列，所以电泳图谱中你所要表达的蛋白，应该比你自己预期的大20-30kDa。

双酶切质粒或的一条带很正常的，因为多克隆区域切下来的那个小片段太少（总碱基mol量），电泳常常是看不到的，这是常见现象。一条带都没有不正常。估计是电泳时间不够吧。

可能是太弱你看不出来，建议用His抗体做个western 看看是不是有条带而看不出。2 是不是融解性太差，建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。

吸取表达载体转入大肠杆菌 BL21（DE3），一管子一般可以转10个，转化步骤同正常大肠杆菌转化。

蛋白不表达的原因很多，有载体的原因，但肯不定不完全是载体的原因。可以试试不同的表达菌株，诱导浓度，诱导温度，诱导时间等等。

最适生长温度37℃；革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢；具有卡那霉素（Km）抗性。将运动发酵单胞菌10232中的adhB基因插入到大肠杆菌表达载体pET28a上，转入大肠杆菌BL21中。主要价值：主要用途是研究；教学。

如果是目的基因里面没有XhoI 和EcoRI的酶切位点，引物设计好了，应该不会出现移码的问题。

根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4TpET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 0为例进行讲解。

到此，以上就是小编对于PET系列载体构建的问题就介绍到这了，希望介绍关于PET系列载体构建的5点解答对大家有用。

[免责声明]本文来源于网络，不代表本站立场，如转载内容涉及版权等问题，请联系邮箱:3801085100#qq.com，#换成@即可，我们会予以删除相关文章，保证您的权利。转载请注明出处：http://www.mxzdyx.cnhttp://www.mxzdyx.cn/zbpj/2774.html