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1. 有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗
2. 试述常规重组载体构建的方法。
3. 过表达载体构建方法
4. 如何构建载体
5. 有关大肠杆菌质粒载体的构建策略包括哪些

1、有用同源重组法进行基因克隆和载体构建的吗

同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达外源基因，因此选择合适的质粒载体是进行同源重组构建质粒的第一步也是非常重要额一步。

无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 515 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。

、载体构建基本原理 分、切、连、转、筛 分：分离出要克隆的的基因及载体。切：限制性内切酶切割的基因和载体，使其产便于连接的末端。

2、试述常规重组载体构建的方法。

目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。目的产物的序列正确后，就可以构建重组载体。主要方法就是酶切目的产物，连接目标载体，转化大肠杆菌感受态，最后鉴定一下单克隆是不是阳性克隆就OK了。

选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。

先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

3、过表达载体构建方法

首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。

图 过表达载体构建示意图目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子。

基因过表达的基本原理是通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。 基因过表达的步骤是： 1，构建克隆。

4、如何构建载体

②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

选择合适的载体：根据实验目的和需要，选择适合的载体。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。 设计引物：根据目标基因的序列，设计合适的引物。引物的设计需要考虑其特异性、长度、GC含量等因素。

首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

载体构建的方法：将外源DNA片段与线性化的质粒进行连接，形成重组质粒。使用适当的转化方法将构建好的质粒转化到目标细胞中，使其能够进入细胞内。

5、有关大肠杆菌质粒载体的构建策略包括哪些

提取质粒，做酶切。酶切的体系要看你所用的酶。（13）酶切后还是需要进行回收。（14）将回收的片段与你已经酶切好的表达载体的片段连接。（15）再转化至大肠杆菌扩增。（16）PCR检菌，酶切检菌。

拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的。

l 1？l 1？l 5？l 10？l 1？l 100？l PCR 反应条件为：94℃变性 3min；94℃变性 3min、52℃复性40sec、72℃ 延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程相似，通常是由多拷贝的E.Coli小质粒为载体。（2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。

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