大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于载体构建测序结果对比的问题，于是小编就整理了5个相关介绍载体构建测序结果对比的解答，让我们一起看看吧。

1. 同样序列,测序之后,发现不同
2. 转化涂板后,同一板上的菌在引物间的测序结果应该是一致的吧?为什么我...
3. 用不同的引物扩增的样品测序完成后可以用来相互对比吗?
4. 用plko.1构建的sh质粒为什么测序结果和引物不一致
5. 这样的测序结果,载体是构建成功了吗?

1、同样序列,测序之后,发现不同

很可能是测序误差 能否找出引物序列是判断测序成功与否的一个有效方法 您也可以用DNAStar 查看测序结果有没有重叠峰，如果没有就是正确的。

多送测几个克隆，如果测的结果跟这次一致，那么没必要重新扩增了。如果必须要得到理想中的序列，那就需要做突变修复。测序一般每个反应开始都不准确，首先排除这个因素。

有可能是在PCR扩增目的片段时，由于未采用高保真DNA聚合酶，导致的碱基突变。也可能是PCR扩增目的片段时，设计的引物特异性不高，或反应体系及参数对特异性控制的不好，获得的是非目的条带。

不管用什么酶扩，有这么多突变很少见，有可能是反转录的问题。

2、转化涂板后,同一板上的菌在引物间的测序结果应该是一致的吧?为什么我...

先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。

第一个问题，只有一个碱基缺失，克隆测序和引物合成都没有问题；第二个问题：酶切连接入载体后，克隆过程就完成了；第三个问题：如果你说的是转化过程的话，应该是先做好连接，再做转化。

测序都是从5端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。

有的会沾在感受态细胞上，还有的虽然在溶液中，涂板时一起就一起涂在板上了，挑菌的时候可能会挑到，即使没挑到，但菌表面的基因片段也有可能被扩增，如果你的循环数太高，就会在PCR时呈现阳性结果。

3、用不同的引物扩增的样品测序完成后可以用来相互对比吗?

比对的时候应该可以不一样长，在后面进行距离或系统树分析时gaps/missing data 一项可选择完全删除（complete deletion）或比对删除（pairwise deletion）。 引物序列因是自己设计的序列，应该删除。

已经设计好的引物序列已经确定，引物特异性、GC值等已满足在本对引物扩增中的应用，若想引物混用，还需要注意：两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。

比对结果简单的说是为了让两条或者多条不同长度序列通过一致性的比较，掐头去尾，使其变成具有可比性的多条序列。如上图，出现很多的空格，就是为了让两条序列有一致性，软件自动添加的。

你可以打开NCBI序列的详细信息，里面有标示是否unpublished，标有unpublished就说明是没有被认可的，这种对比结果你是不能采用的，因为对比的对象都是不可信的。

4、用plko.1构建的sh质粒为什么测序结果和引物不一致

同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证。

第一个问题，只有一个碱基缺失，克隆测序和引物合成都没有问题；第二个问题：酶切连接入载体后，克隆过程就完成了；第三个问题：如果你说的是转化过程的话，应该是先做好连接，再做转化。

pcr引物和测序引物是可以通用的，最多是纯化方式不一样，测序的要求高一些。最重要的是，pcr扩增是从引物开始的，而测序一般要从引物下游几十个bp以后，信号才逐渐稳定，能够读出来。

主要的问题在于引物，引物配对的时候，很有可能不在序列的顶端配对，所以得到的序列自然就会少了。

5、这样的测序结果,载体是构建成功了吗?

如果蓝色部分是你的目的基因，然后两边载体序列也对，那这个载体就没问题了。

说明载体未构建成功。应重新进行PCR，直到获得清晰的条带。如果得不到，可以检查RACE的引物，PCR的条件等，并做适当优化。

不都测通。载体构建的成功与否取决于多种因素，如酶切位点选择、连接反应条件和宿主细胞类型。挑战包括不适合的酶切位点、连接条件不理想和宿主细胞状态。

构建过程中出现了失误：在构建构载体的过程中，出现了操作失误，导致某一段序列没有被正确地插入到构载体中。测序误差：构建好的构载体需要进行测序，有时会出现测序误差，导致测序结果不完整，缺失了某一段序列。

到此，以上就是小编对于载体构建测序结果对比的问题就介绍到这了，希望介绍关于载体构建测序结果对比的5点解答对大家有用。