大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于载体构建为啥要双酶切的问题，于是小编就整理了3个相关介绍载体构建为啥要双酶切的解答，让我们一起看看吧。

1. 构建重组表达质粒前,还需要将空表达载体和重组克隆质粒进行双酶切...
2. 构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因
3. 构建基因表达载体的过程中,切割质粒和 目的基因时 是否需要同一种限制...

1、构建重组表达质粒前,还需要将空表达载体和重组克隆质粒进行双酶切...

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。

将一个目的基因连接到质粒上，一般用两种DNA内切酶做双酶切，使目的基因和被切开的质粒片段两端都有特异性的粘性末端，然后用DNA连接酶把目的基因与质粒片段连起来。

先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

\验证重组质粒的构建是否成功，如果成功了，电泳应该是载体片断和插入序列两条条带，分别对应应有的长度。

2、构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因

为了防止目的基因和运载体自身环化。为保证目的基因正序插入运载体，防止反向连接。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

用不同限制酶切割的目的是：保证目的基因和质粒（运载体）的准确连接，避免无效连接过多。

构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。

有两个方面，一是载体本身酶切不充分，没有完全切开；二是去磷酸化不充分。

3、构建基因表达载体的过程中,切割质粒和 目的基因时 是否需要同一种限制...

目的基因和质粒要[同时]用同一种限制性核酸内切酶切割，不然就没法连了。但最好用不同的限制酶切两端（切目的基因是不是应该切两下么），防止载体自连或目的基因自连。啊啊，这道题。

不可以，只能用同一种限制酶来切割质粒和目的基因。原因是，用同一种限制酶来切割，可以产生相同的黏性未端，如果用两种限制酶切割，产生的黏性未端一般不相同。

构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。

解析：在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA片段的连接。

一般情况下是的，因为只有这样才能有相同的黏性末端，目的基因和运载体才能重组。但也有两种不同的内切酶产生相同的黏性末端如G↓ATTCG 和↓ATTC。

到此，以上就是小编对于载体构建为啥要双酶切的问题就介绍到这了，希望介绍关于载体构建为啥要双酶切的3点解答对大家有用。