本篇文章给大家谈谈载体构建单菌落长的很大，以及获得单菌落的关键对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。 今天给各位分享载体构建单菌落长的很大的知识，其中也会对获得单菌落的关键进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

1. DNA克隆,单菌落很多,检测不到目的条带,求高人指点
2. 为什么质粒构建只长了一个菌落
3. t载体做转化 一直长不出单菌落是什么原因
4. 试述常规重组载体构建的方法。
5. 急急急~构建重组质粒时,载体2.6kb,目的片段5.8kb,目的片段太大对实验...

1、DNA克隆,单菌落很多,检测不到目的条带,求高人指点

另，能长出很多单菌落，说明你的板子、感受态都没有问题。

如果PCR系统没有问题，很可能是质粒和染色体发生了重组。建议提细菌的genome DNA 做一次PCR。如果是阳性，就说明是这样。另外，还可以另挑几个菌落，重新提质粒扩增。

可能是目的基因没有整合到32a中；可能是PCR模板量不足；可能是挑取的菌落为假阳性；可能是PCR反应条件不合适。还有的时候出现的极端的原因，是细菌就是无法整合这个基因，所以无论如何都无法得到阳性结果，我就遇到过这种情况。

如果实在没有IPTG和X-gal，也最好能先挑几个单菌落去做菌落PCR，从中选取阳性的菌落去做液体摇菌，提质粒，找一个目标判断上有的酶做一个单切，同时用自连的空载作为对照，看是否能够切开。

点样空有没有东西？可能有蛋白污染，所以都堵在点样空，你看到的白色沉淀可能就是蛋白含量太高。2 操作太剧烈，活有DNase 污染，DNA都降解成小片段，跑出胶。

2、为什么质粒构建只长了一个菌落

如果电转后板子上只长了一个菌落，有可能是以下原因导致的： 转化效率低：在电转过程中，外源DNA要能够成功导入到目标细胞内才能实现目标基因的表达或改变。

土壤微生物分离和纯化的实验，它只出现一个菌落，那也就是因为土壤里面的一个偷懒的级别，所以他的微生物就会一个比较小的微生物，所以它这个分离和纯化实验就需要达到一个标准，就可以出现一个菌体。

如果你没有做菌落PCR的鉴定，还有一种可能就是你的板子上的抗生素浓度不够，导致长出了菌，这个菌到底含不含有你的目的质粒，要做PCR鉴定，不要光看菌落长出与否。

是。质粒先是被转化到大肠杆菌中，然后挑选单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，所以质粒提取时挑菌必须是单菌落。

3、t载体做转化 一直长不出单菌落是什么原因

建议你把连接用的片段重新PCR一下，关键把片段的浓度提上去。片段量太少可能会导致自连的比例就大。

我用的peay t-3蓝白斑筛选，效果还可以。

感受态不好。“待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）”，你测OD了吗？其实很麻烦，建议稍微有点混就好用了；感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长？菌株与质粒不兼容。转化体系也很关键。

仔细观察以上问题，考虑是否转化不成功。培养基的体积是否小于试管体积的1/5？摇菌转数是否达到250rpm，试管要斜放？是否观察过菌体生长过程（2-6小时生长情况），是否有噬菌体污染？如果转化成功，则需要考虑菌体生长环境。

4、试述常规重组载体构建的方法。

目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。目的产物的序列正确后，就可以构建重组载体。主要方法就是酶切目的产物，连接目标载体，转化大肠杆菌感受态，最后鉴定一下单克隆是不是阳性克隆就OK了。

选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。

5、急急急~构建重组质粒时,载体2.6kb,目的片段5.8kb,目的片段太大对实验...

首先，连接的成功率低；其次，最重要的，连接上，转化后，能否成功增值表达，是个难题。找找有没有表达大片段的载体吧。

连接产物转化大肠杆菌，涂对应抗生素LB平板。37度培养过夜后，挑取单克隆菌落接入少量含抗生素的LB培养基，37度摇床上培养过夜。收集菌液中的菌体，抽提质粒。

粘末端变成平末端有两种方法：klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。为了减少载体自连，可以用 碱性磷酸酶 处理载体。最后将载体和 目的基因 链接，构建 重组质粒 。

大肠杆菌为原核生物，原核生物的基因序列中不含有内含子，也就没有内含子的剪切机制，而真核生物中获得的完整的基因片段中一定是含有内含子的，（mRNA中不含）所以，在表达上会有差异。

D对，是因为，这基因你都插进去了，表达的时候，自然要翻译出相应的蛋白质来。

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