大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于构建载体可以用双酶切吗的问题，于是小编就整理了4个相关介绍构建载体可以用双酶切吗的解答，让我们一起看看吧。

1. 构建基因表达载体的过程中,切割质粒和 目的基因时 是否需要同一种限制...
2. 质粒载体的构建步骤
3. ...重组表达质粒前,还需要将空表达载体和重组克隆质粒进行双酶切吗?
4. 如何将目的基因与已经构建好的载体拼接???

1、构建基因表达载体的过程中,切割质粒和 目的基因时 是否需要同一种限制...

目的基因和质粒要[同时]用同一种限制性核酸内切酶切割，不然就没法连了。但最好用不同的限制酶切两端（切目的基因是不是应该切两下么），防止载体自连或目的基因自连。啊啊，这道题。

不可以，只能用同一种限制酶来切割质粒和目的基因。原因是，用同一种限制酶来切割，可以产生相同的黏性未端，如果用两种限制酶切割，产生的黏性未端一般不相同。

构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。

解析：在基因表达载体的构建过程中用同种限制酶来切割目的基因和质粒，使之产生相同的黏性末端，以利于DNA片段的连接。

一般情况下是的，因为只有这样才能有相同的黏性末端，目的基因和运载体才能重组。但也有两种不同的内切酶产生相同的黏性末端如G↓ATTCG 和↓ATTC。

2、质粒载体的构建步骤

根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。

同源重组构建质粒步骤是选择合适的质粒载体、构建同源重组质粒、筛选带有外源DNA序列的质粒。选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

通过PCR扩增目的基因片段 PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

您好，我就为大家解答关于重组质粒的构建步骤是，重组质粒的构建步骤相信很多小伙伴还不知道，现在让我们一起来看看吧！目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。

3、...重组表达质粒前,还需要将空表达载体和重组克隆质粒进行双酶切吗?

如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12，000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟 DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。

但是单酶切容易出现反向连接和自身环化的问题（可以自己在草稿纸上举例试一试），所以现在的技术多采用双酶切，即目的基因两端的粘性末端不同，从而防止反向连接和自身环化，有效提高形成重组DNA的效率。

表达载体不同：原核表达载体构建重组表达载体：载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

4、如何将目的基因与已经构建好的载体拼接???

第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物选修3中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。

相同的限制性核酸内切酶及DNA连接酶 前者在供体和受体上分别进行切割 使目的基因的两端与运载体有相同的粘性末端 DNA连接酶则将其连接 请点击采纳，谢谢。

【答案】：C 把目的基因连接到载体上去，要经过一系列酶促反应，需要几种工具酶，这中间最为重要的是两大类酶：①DNA限制性内切酶：把载体DNA片段切开。②DNA连接酶：用于连接载体和外源DNA片段。

先用相同的限制性内切酶处理目的基因与载体。 再用DNA连接酶连接粘性末端。

到此，以上就是小编对于构建载体可以用双酶切吗的问题就介绍到这了，希望介绍关于构建载体可以用双酶切吗的4点解答对大家有用。