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1. 同源重组法构建载体原理
2. 无缝克隆引物不含酶切位点设计原理
3. 无缝克隆技术原理
4. 基于无缝克隆技术构建基因敲除载体

1、同源重组法构建载体原理

此时暴露出载体以及片段的3’同源序列，经过碱基互补配对，DNA 聚合酶添加缺失碱基后由 DNA 连接酶将片段与载体进行连接，从而达到载体重组的功能。

同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达外源基因，因此选择合适的质粒载体是进行同源重组构建质粒的第一步也是非常重要额一步。

温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

粘末端变成平末端有两种方法：klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。为了减少载体自连，可以用碱性磷酸酶处理载体。最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。

2、无缝克隆引物不含酶切位点设计原理

无缝克隆的原理 首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。

无缝克隆技术原理是依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌。目标区域选择：首先，通过人工或计算机自动化算法，选择要进行无缝克隆的目标区域，并提取出该区域的图像信息。

一步法同源重组是一种利用同源重组的原理，进行无缝克隆的技术。该技术无需考虑酶切位点，几乎适用于任何载体与任何片段的定向克隆。操作过程简单快速，只需50℃，20min即可完成反应。

无缝克隆技术的基本原理是利用PCR技术（聚合酶链式反应）在体外扩增目标序列，并加入诸如限制酶等基因工具，将扩增后的DNA片段粘接到载体上，构建达到需要的目的序列。

3、无缝克隆技术原理

无缝克隆技术原理是依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌。目标区域选择：首先，通过人工或计算机自动化算法，选择要进行无缝克隆的目标区域，并提取出该区域的图像信息。

无缝克隆技术，是指以DNA为模板，在实验室内自行合成完整的基因或基因组，实现对生物体的精准复制。这一技术是基因工程领域的重要研究方向之一，可以应用于生物医学、农业、工业等众多领域。

无缝克隆的原理 首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。

无缝克隆的原理首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibsonassembly和GoldenGateassembly。

Golden Gate克隆方法，将多个目的基因片段按照设定的顺序连接，实现多基因片段一步无缝连接。为编辑小鼠β酪蛋白基因位点，利用Golden Gate克隆法，构建了小鼠β酪蛋白基因位点同源重组靶向载体。

4、基于无缝克隆技术构建基因敲除载体

ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的 DNA 无缝克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 ClonExpressII 是新一代重组克隆试剂盒，包含增强的重组酶 ExnaseII。

无缝克隆技术的基本原理是利用PCR技术（聚合酶链式反应）在体外扩增目标序列，并加入诸如限制酶等基因工具，将扩增后的DNA片段粘接到载体上，构建达到需要的目的序列。

无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 515 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。

无缝克隆的原理 首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。

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