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1. 为什么要构建双元载体系统
2. 基因载体构建时,为什么要构建标记基因的上下游两个载体?
3. 大片段载体的分段构建二(两步PCR法)
4. 重组质粒构建 一个DNA为什么要接入两个不同的载体?

1、为什么要构建双元载体系统

解决常规载体系统在基因传递过程中存在的一些问题，如基因表达不稳定、慢速和低效等。提高基因转染的效率和准确性。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

教育领域：双元制是源于德国的一种职业培训模式，所谓“双元”是指在职业培训中，要求参培人员必须经过两个场所的培训。

2、基因载体构建时,为什么要构建标记基因的上下游两个载体?

一般都是两个或两个以上。比如说你要判断是否准确地插入载体，那一般就是利用检查某标记基因是否被破坏；然后又如LS所说哪个是转入了合成后的载体，那就要再加一个什么类似抗某抗生素的基因。

基因表达载体 的构建的目的：使 目的基因 在 受体细胞 中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。组成：目的基因 启动子 终止子 标记基因 。

构建基因表达载体的目的是什么 基因表达载体的构建是基因工程最重要的一个步骤。将目的基因与载体通过DNA连接酶连接形成一个整体，方便后续载体携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因成功与受体细胞转导。

基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。

3、大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

首先一下是基因的全长，根据预实验结果，在红线那个位置分隔开，将其分成1-3010的 a 段及3011-6810的 b 段两个片段。一般来说4kb以下还是很好构建的。

步骤不同：两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，而三步法则分两次完成。用时不同：两步法减少一次升降温过程，提高了反应速度，用时较短。而三步法则比两步法用时更长。

PCR的技术的主要步骤：DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

设计一对引物，针对基因两端（覆盖酶切位点），在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基，扩增以后，酶切产物和空载体，再连接一遍，转化，小提拿去测序。

4、重组质粒构建 一个DNA为什么要接入两个不同的载体?

首先，扩增出DNA片段，连接到中间载体上（比如说pEASY），然后转化到大肠杆菌中。此步骤在大肠杆菌中能够高保真性复制，提高碱基的保真性，另外也起到增加目的片段的浓度的目的。提到的质粒也方便测序（因为中间载体片段较小）。

基因工程中标记基因必不可少，基因工程的核心步骤，构建基因表达载体，中用标记基因检测重组质粒是否已经导入受体细胞中，从而区分己导入细胞和未导入细胞。（标记基因通常是抗生素基因。

大的质粒（大于15kb）不会很好转化而且DNA产量通常很低。在设计实验时要考虑到加入插入片段的最终载体大小，尽量用更小的载体。兼容性 当多于一个质粒载体必须同时存在于同一个细菌细胞中，这两个质粒的复制子必须是兼容的。

同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

这个是为了避免外源DNA和外源菌的污染而设计的两个对照。受体菌对照是为了避免外源DNA污染，而质粒对照则是为了避免外源菌污染。这个是为了实验科学严谨性而设计的。当然在实际应用中大部分转化实验均不需要做对照。

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