大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于同源重组法构建载体引物的问题，于是小编就整理了3个相关介绍同源重组法构建载体引物的解答，让我们一起看看吧。

1. 同源重组法构建载体原理
2. 同源重组构建质粒原理
3. 同源重组构建质粒步骤

1、同源重组法构建载体原理

此时暴露出载体以及片段的3’同源序列，经过碱基互补配对，DNA 聚合酶添加缺失碱基后由 DNA 连接酶将片段与载体进行连接，从而达到载体重组的功能。

同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达外源基因，因此选择合适的质粒载体是进行同源重组构建质粒的第一步也是非常重要额一步。

温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

粘末端变成平末端有两种方法：klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。为了减少载体自连，可以用碱性磷酸酶处理载体。最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。

2、同源重组构建质粒原理

同源基因编辑原理：CRISPR/Cas9系统是一种原核生物的免疫系统，是细菌用来抵抗病毒和外源质粒入侵的一种防御机制。

那就要看是什么菌种的，有些菌种是重组酶缺陷的，比如TOPstbl3等等，有些菌种表达重组酶，只要有同源序列，就容易发生重组。你要好好看看菌种的说明书，看看是不是重组缺陷的。

在同源重组构建质粒中，外源DNA序列与质粒DNA序列具有相同的序列段，可以通过该序列段实现重组。筛选带有外源DNA序列的质粒：为了筛选带有外源DNA序列的质粒，通常会在质粒中加入选择标记，例如抗生素抗性基因。

需要。根据个人图书馆中的相关信息，同源重组克隆技术在进行TA克隆构建重组质粒时，需要考虑外源片段上是否有需要用到的酶切位点，是否会发生移码，如果有就无法正确的构建重组质粒。

最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。设计引物，自带酶切位点，扩增目的基因，直接改变目的基因的酶切位点，然后再用和载体相同的限制酶酶切目的基因，切出相同的粘性末端。直接将酶切完成的目的基因和载体连接。

3、同源重组构建质粒步骤

通过上述步骤，就可以把特定的基因克隆到所需的质粒中，从而完成对基因的表达分析，以及下一步的功能分析。同源重组构建质粒原理在分子克隆技术中占有不可替代的重要地位，是决定新型载体能否稳定表达基因的关键技术。

构建含双启动子，能定向快速克隆PCR产物的供体质粒。

同源重组敲除的验证主要包括以下步骤：选择拟敲除基因的上下游约500~1000 bp片段作为同源臂，将同源臂克隆到携带筛选标记基因的质粒载体中。选择合适的限制性内切酶切割载体，引入双链断裂。

最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。设计引物，自带酶切位点，扩增目的基因，直接改变目的基因的酶切位点，然后再用和载体相同的限制酶酶切目的基因，切出相同的粘性末端。直接将酶切完成的目的基因和载体连接。

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