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1. pcr结果测序是不是都需要构建载体
2. 为什么要构建表达载体
3. 构建载体测序的目的
4. 基因表达载体的构建过程中必须遵循哪些原则?

1、pcr结果测序是不是都需要构建载体

尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。测序需要。

另外，如果要做后续表达，也必须考虑到引物合成中不可避免的偶发错误，克隆到载体再测序可以清楚的检测。再者，还有比如引入酶切位点，正反向连接等特定实验要求的考虑。

可以不同克隆到载体上。dna测序过程，其实是pcr的过程，你只要有足够的模板用于pcr反应就行，不一定要克隆到载体上。

一般情况下PCR产物直接用引物测序即可，无需克隆连接到载体上。直接测序时所得到的结果是不包含引物区序列的，如果想获得PCR产物的完整序列（包含引物区），就必须克隆后再测序。

主要是因为测序的原因，获得的全长序列要经过测序验证，而目前的测序技术有限，在序列的起始端准确性不高，所以想要获得准确的全长序列就需要克隆到载体上。想弄得更明白些的话你得了解一下测序的原理。

2、为什么要构建表达载体

得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。

构建基因表达载体的原因是因为如果没有表达载体，基因是无法进入目的细胞的，只需要记住在植入基因时构建载体即可。表达载体是必须构造的，一般为质粒（小型环状DNA）。

基因表达载体 的构建的目的：使 目的基因 在 受体细胞 中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。组成：目的基因 启动子 终止子 标记基因 。

基因表达载体的构建，即目的基因和运载体结合，是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

基因表达载体的构建是基因工程最重要的一个步骤。将目的基因与载体通过DNA连接酶连接形成一个整体，方便后续载体携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因成功与受体细胞转导。

3、构建载体测序的目的

得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

主要用来确定序列的首尾部分。因为测序的技术原因，测序开始的几十个碱基以及大概800个bp之后的碱基都是无效的，有效的只有中间几百个bp，具体为何这里就不赘述了。

所有的序列都被测出。这是一项大工程，需要一个大数据库，呵呵。由大化小，又由小得大，妙啊。所以说DNA测序克隆到载体上是为了解决大片断DNA难以直接测定的问题，毕竟一次测定的DNA序列长度是有限的。就这些，呵呵。

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

4、基因表达载体的构建过程中必须遵循哪些原则?

切割质粒和目的基因的限制酶必须是同-.种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。

作为一个基因表达载体，必须要满足以下条件：细菌的复制起始位点Ori；用来对转入质粒的细菌进行筛选的抗性基因比如：Kan Amp spec 等抗性筛选基因。

应用t7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有t7噬菌体rna聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有t7噬菌体启动子的载体。

构建条件：必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。具有多个限制酶切点，从而可以使不同的粘性末端与之相连，增强实用性。

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