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1. LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计
2. 2020-12-03 慢病毒
3. 如何利用慢病毒载体构建稳定表达外源基因的细胞系
4. 如何快速设计shRNA

1、LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计

构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。

第一次PCR：F R1 cDNA→A，F1 R cDNA→B；因为F和R端是全长的两端。因此需要设计出所需要的酶切位点 ，这个可以根据自己的载体来确定。

下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达，分别采用T/A克隆，传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。（1） T/A克隆 T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法（图15）。

2、2020-12-03 慢病毒

慢病毒载体（lentivirus vector， LV）是一类来源于逆转录病毒的载体， 慢病毒之所以是称为慢病毒，是因为感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病。gag、pol和env。

存储条件及期限 置于-80℃冰箱保存；使用病毒时，取出置于4℃融化后进行细胞感染。避免反复冻融降低病毒滴度 每次冻融会降低病毒滴度10%~20%左右；为避免反复冻融建议按照每次的使用量进行分装。

慢病毒操作较方便，周期也短。但腺病毒表达快，1-2天，慢病毒要2-4天。

慢病毒（Lentivirus） 载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

3、如何利用慢病毒载体构建稳定表达外源基因的细胞系

构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。

含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3） 培养 48hrs – 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。4） 病毒的纯化和浓缩。

携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。

原代细胞较难转染，可以先构建慢病毒，再用慢病毒进行转染。将actin基因，放入慢病毒融合表达载体，与荧光蛋白（GFP）融合表达，注意避免移码突变。

4、如何快速设计shRNA

ShRNA 的设计原则 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5～6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。

设计具有两端反向重复序列的片段，插入表达载体内即可。目前有构建shRNA的试剂盒出售的。

引物不跨外显子设计也可以，但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因组，你实验的时候可以做一个NRT的对照看一下有没有基因组污染。

在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。 ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中，进行双酶切和测序鉴定。结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中，测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。

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