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1. 如何构建RNA干扰载体
2. 【求助/交流】目的基因与表达载体连接时有哪些要点?
3. 真核生物的基因在原核生物基因进行表达时的注意事项 有哪些
4. 构建cdna文库时,如何保证双链cdna与表达载体以正确的方向连接?
5. 基因表达载体的构建所需的条件

1、如何构建RNA干扰载体

要利用RNAi技术研究基因的功能，首先要构建RNA载体。

用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。

rna干扰引物设计原则是碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误。

siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。

2、【求助/交流】目的基因与表达载体连接时有哪些要点?

选择合适的限制性内切酶：在连接双链cDNA和表达载体时，需要使用限制性内切酶进行切割。选择合适的限制性内切酶可以保证连接的方向正确。

第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物选修3中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。

目的基因具有从起始密码子到终止密码子的方向性，必须正向连接才能获得正确克隆，构建的载体才能正确表达目的蛋白。相同的限制性核酸内切酶及DNA连接酶。

主要是选用正确的适当的限制酶切割，以便能连接，而且连接的方向不会错误。

切割质粒和目的基因的限制酶必须是同-.种酶，以获得相同的黏性末端，利于重组质粒的构建。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。

3、真核生物的基因在原核生物基因进行表达时的注意事项 有哪些

所以真核细胞的 DNA要在原核中表达，就只要 外显子 就够了。就要把 内含子 去掉。

除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如调节基因和操纵基因。原核生物基因转录终止之前同样有一段回文序列结构，称为终止子，它的特殊的碱基排列顺序能够阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来。

此外，原核生物的基因中不含内含子，真核生物基因中存在内含子。内含子是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。

不能。因为真核生物的基因中有内含子，而原核生物不具有将内含子转录的部分进行加工的功能，所以真核生物的基因要想在原核生物细胞中表达，必须是人工合成的，而不能将原来真正的完整的基因导入原核生物的细胞中。

4、构建cdna文库时,如何保证双链cdna与表达载体以正确的方向连接?

是这个意思，当你设计引物的时候，在互补序列的外侧可以再加一些核酸序列，这里面你可以设计一些酶切位点进去，外面再连上保护碱基就可以了。

这种方法最大的优点是可以获得十分接近全长的双链cDNA产物，另外还有直接利用第一链的反应产物、无须处理和纯化以及很高效率的特点。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。

因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。

5、基因表达载体的构建所需的条件

作为一个基因表达载体，必须要满足以下条件：细菌的复制起始位点Ori；用来对转入质粒的细菌进行筛选的抗性基因比如：Kan Amp spec 等抗性筛选基因。

构建条件：必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。具有多个限制酶切点，从而可以使不同的粘性末端与之相连，增强实用性。

必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。

所有的载体都需具备三个条件：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA，也包括表达由载体编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。

到此，以上就是小编对于构建表达载体实验注意事项的问题就介绍到这了，希望介绍关于构建表达载体实验注意事项的5点解答对大家有用。