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1. 试述常规重组载体构建的方法。
2. 如何构建RNA干扰载体?
3. 酵母双杂交诱饵载体的构建方法?
4. 真菌表达载体怎么构建?求 真菌表达载体构建的师兄师姐指点?万分感谢...
5. 质粒载体的构建步骤

1、试述常规重组载体构建的方法。

目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。目的产物的序列正确后，就可以构建重组载体。主要方法就是酶切目的产物，连接目标载体，转化大肠杆菌感受态，最后鉴定一下单克隆是不是阳性克隆就OK了。

选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。

2、如何构建RNA干扰载体?

“酶切-连接”方法是通常构建RNA干扰载体最常用的方法，被广泛应用于各种生物之中。其构建过程是：通过PCR方法得到目的基因的片段（添加了合适的酶切位点），使之正反相连形成顺式片段和反式片段。

构建完成后，将RNA载体输入到细胞中，就可以进行RNA干扰，从而研究基因的功能。

用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。

rna干扰引物设计原则是碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误。

3、酵母双杂交诱饵载体的构建方法?

构建酵母双杂交载体 首先需要构建酵母双杂交载体，该载体包含两个重要的部分：一个携带蛋白质结构域的DNA结合域和一个携带转录激活域的DNA结合域。

可参考：诱饵基因转化筛库宿主菌Y190 1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时（过夜），OD600 达到2 左右。

具体实验步骤如下：构建酵母表达载体：将含有自身复制元件2μ、酵母转录起始序列、选择性筛选的标记基因等元件的酵母表达载体与感兴趣的蛋白质基因融合，在表达载体中得到融合基因。

将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒；将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母；再将文库质粒转化到酵母中；通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。

4、真菌表达载体怎么构建?求 真菌表达载体构建的师兄师姐指点?万分感谢...

构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的 D N A 序列，称为同源重组片段或定位片段（ T a r g e t i n g f r a g m e n t ）。

获取目的基因：用限制性核酸内切酶切割下目的基因。基因表达载体的构建：将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。将目的基因导入受体细胞：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。

从自然界中筛选出产褪黑素合成基因的来源。这些基因可以来自于植物、真菌、动物等多种生物。将筛选出的基因进行克隆和序列分析，确定其序列和功能。

Joutsjoki（1993）构建了两种一步基因置换载体。一种载体含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因组基因（gamP），另一种含有相应的cDNA，都在T.reesei cbh1启动子控制下表达。这些载体经转化后置换T.reesei的cbh1基因。

5、质粒载体的构建步骤

根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。

同源重组构建质粒步骤是选择合适的质粒载体、构建同源重组质粒、筛选带有外源DNA序列的质粒。选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

通过PCR扩增目的基因片段 PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

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