大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于两种构建重组dna分子载体的问题，于是小编就整理了3个相关介绍两种构建重组dna分子载体的解答，让我们一起看看吧。

1. 试述常规重组载体构建的方法。
2. 构建重组载体需要两种限制酶
3. 重组质粒构建 一个DNA为什么要接入两个不同的载体?

1、试述常规重组载体构建的方法。

目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。目的产物的序列正确后，就可以构建重组载体。主要方法就是酶切目的产物，连接目标载体，转化大肠杆菌感受态，最后鉴定一下单克隆是不是阳性克隆就OK了。

选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

载体构建目的 ①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

目的基因制备和分离：一般通过文库筛选、同源序列比对等方法进行克隆。2）DNA重组载体的构建：选择植物表达载体，根据载体选择或添加酶切位点，然后进行酶切连接，构建重组载体。

2、构建重组载体需要两种限制酶

是的，在构建重组表达质粒之前，通常需要对空表达载体和重组克隆质粒进行双酶切。双酶切是指使用两种限制性内切酶对DNA进行切割，以产生互补的黏性末端或平滑末端。

构建重组质粒时并不是只用同种限制酶切割目的基因和载体，虽然理论上本应如此，一般都用同种才会容易处理，但常见的也有将两种限制性内切酶，也就是不同的限制酶进行双酶切，最后也会产生互补的黏性末端。

一般会使用相同的两个限制性核酸内切酶对目的基因和载体进行切割，使它们产生相同的末端，可以在T4 dna 连接酶的作用下，进行连接反应，构建重组质粒。

先用限制酶分别处理目的基因和运载体，使之露出相同的黏性末端；将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处，再用DNA连接酶将处理好的目的基因和运载体的黏性末端接好，就完成了基因的重组。

如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

3、重组质粒构建 一个DNA为什么要接入两个不同的载体?

首先，扩增出DNA片段，连接到中间载体上（比如说pEASY），然后转化到大肠杆菌中。此步骤在大肠杆菌中能够高保真性复制，提高碱基的保真性，另外也起到增加目的片段的浓度的目的。提到的质粒也方便测序（因为中间载体片段较小）。

基因工程中标记基因必不可少，基因工程的核心步骤，构建基因表达载体，中用标记基因检测重组质粒是否已经导入受体细胞中，从而区分己导入细胞和未导入细胞。（标记基因通常是抗生素基因。

大的质粒（大于15kb）不会很好转化而且DNA产量通常很低。在设计实验时要考虑到加入插入片段的最终载体大小，尽量用更小的载体。兼容性 当多于一个质粒载体必须同时存在于同一个细菌细胞中，这两个质粒的复制子必须是兼容的。

同源重组构建质粒原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

这个是为了避免外源DNA和外源菌的污染而设计的两个对照。受体菌对照是为了避免外源DNA污染，而质粒对照则是为了避免外源菌污染。这个是为了实验科学严谨性而设计的。当然在实际应用中大部分转化实验均不需要做对照。

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