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1. 如何进行植物基因工程中的载体构建
2. 大片段载体的分段构建二(两步PCR法)
3. 可以同时将2个目的片段克隆到同一载体的同一位点吗
4. 质粒载体的构建步骤

1、如何进行植物基因工程中的载体构建

①用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去。②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。理想的运载体是质粒（plasmid），在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

载体构建：将目的基因通过酶连接到一个特定质粒分子上，构成一个插入目的片段的新的质粒分子。 遗传转化：最简单的花序浸染，常用的农杆菌转化、基因枪轰击，还有花粉管通道等。

载体构建的方法：将外源DNA片段与线性化的质粒进行连接，形成重组质粒。使用适当的转化方法将构建好的质粒转化到目标细胞中，使其能够进入细胞内。

在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。

2、大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

首先一下是基因的全长，根据预实验结果，在红线那个位置分隔开，将其分成1-3010的 a 段及3011-6810的 b 段两个片段。一般来说4kb以下还是很好构建的。

步骤不同：两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，而三步法则分两次完成。用时不同：两步法减少一次升降温过程，提高了反应速度，用时较短。而三步法则比两步法用时更长。

PCR的技术的主要步骤：DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

设计一对引物，针对基因两端（覆盖酶切位点），在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基，扩增以后，酶切产物和空载体，再连接一遍，转化，小提拿去测序。

根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。

3、可以同时将2个目的片段克隆到同一载体的同一位点吗

答案的两个要点其实就是我们做载体构建两个基本侧略。平末端连接和粘性末端连接。第一种就是采用粘性末端连接的策略。

当然，你把2个序列同时克隆到一个质粒也可以。可以用2个启动子分别驱动，或者串在一起，中间用核糖体结合序列相连，这样翻译的时候可以保证2者都得到翻译。

gateway载体一般都是含有两个交换位点attL1和attL2，这两个位点和入门载体上的attR1和attR2的交换位点分别进行重组，从而将目的基因插入到表达载体中。从这个角度来看，很难有可以插入两个基因的gateway载体。

TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻中获得了成功。

4、质粒载体的构建步骤

根据你已知的序列设计带有酶切位点的引物。（2）PCR，跑胶，看看你的目的条带大小对不。（3）条带对的话再重新跑个大孔胶，然后切胶回收。

同源重组构建质粒步骤是选择合适的质粒载体、构建同源重组质粒、筛选带有外源DNA序列的质粒。选择合适的质粒载体：首先需要选择合适的质粒载体，考虑到外源基因的大小、表达强度和选择标记等因素。

通过PCR扩增目的基因片段 PCR要设计引物，设计引物时要选择合适的同源序列，根据质粒载体和基因序列要选择合适的酶切位点，PCR的产物要纯化。

您好，我就为大家解答关于重组质粒的构建步骤是，重组质粒的构建步骤相信很多小伙伴还不知道，现在让我们一起来看看吧！目的基因是以生物基因组DNA为模板，设计引物，PCR出来的。

载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。

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