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1. 大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

1、大片段载体的分段构建二(两步PCR法)

首先一下是基因的全长，根据预实验结果，在红线那个位置分隔开，将其分成1-3010的 a 段及3011-6810的 b 段两个片段。一般来说4kb以下还是很好构建的。

步骤不同：两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，而三步法则分两次完成。用时不同：两步法减少一次升降温过程，提高了反应速度，用时较短。而三步法则比两步法用时更长。

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

设计一对引物，针对基因两端（覆盖酶切位点），在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基，扩增以后，酶切产物和空载体，再连接一遍，转化，小提拿去测序。

构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接（一般用λ噬菌体载体）；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。

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