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1. 构建酵母双杂载体,其中一个基因老是连接不上是什么原因

1、构建酵母双杂载体,其中一个基因老是连接不上是什么原因

⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。

当载体与目的基因连接不上时，应该去进行载体优化：目的基因具有从起始密码子到终止密码子的方向性，必须正向连接才能获得正确克隆，构建的载体才能正确表达目的蛋白。相同的限制性核酸内切酶及DNA连接酶。

酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子， 如GALGCN等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域（DNA-binding domain）和转录激活结构域（transcription-activating domain）。

因为转进去的两个质粒上具有合成两种氨基酸的基因，所以在两缺板子上能生长。如果两个蛋白能互作，报告基因被激活，所以能在三缺或四缺板子上生长，如果不能互作，就不生长。

假阳性现象 多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。

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