构建载体有突变(构建载体的详细过程)
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1、构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程
接下来,我们将探索构建一个野生型TNF-α真核表达载体的详细过程。构建TNF-α的遗传密码首先,从生物数据库下载TNF-α的完整序列,锁定编码区(CDS),如图5-8所示,这是实验的起始点。
当拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。
通过多聚酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段中引入所需变化(通常是有利的),包括碱基对的增添、缺失和替换等。定点突变能迅速,高效地改变DNA所表达的目的蛋白,从而影响生物性状,是基因研究工作中一种非常有用的手段。
基因表达载体的构建(即目的基因与运载体结合)是实施基因工程的第二步,也是基因工程的核心。 将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。
过表达载体主要是将目的基因的编码区(CDS)构建到相应的质粒或者病毒载体中,达到在目的基因过量表达的作用。过表达载体的主要元件:Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。
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