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1. 构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程

1、构建编码区点突变基因序列及表达载体实验全过程

接下来，我们将探索构建一个野生型TNF-α真核表达载体的详细过程。构建TNF-α的遗传密码首先，从生物数据库下载TNF-α的完整序列，锁定编码区（CDS），如图5-8所示，这是实验的起始点。

当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。

过程：首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同 一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。

过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。过表达载体的主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。

定点突变实验注意事项 引物设计时须参照引物设计原则，注意引物中的GC含量，引物长度等，可在引物的两端选择G或者C，可以提高引物和模板结合的概率。

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