大家好，今天小编关注到一个比较有意思的话题，就是关于慢病毒表达载体构建的研究手段的问题，于是小编就整理了1个相关介绍慢病毒表达载体构建的研究手段的解答，让我们一起看看吧。

1. 如何快速设计shRNA

1、如何快速设计shRNA

要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的 靶点 、 loop序列 ， 酶切位点序列 ，详见 LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计 - 引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100 μM。

ShRNA 的设计原则 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5～6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

设计具有两端反向重复序列的片段，插入表达载体内即可。目前有构建shRNA的试剂盒出售的。

克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中，进行双酶切和测序鉴定。结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中，测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。结论所设计的shRNA编码序列被正确插入质粒骨架，成功构建了BRAF基因序列特异性的shRNA质粒载体。

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