载体构建工具大全图解-载体构建工具大全图解下载
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1、如何构建载体
首先,要进行目的基因的获取。这是载体构建的第一步,也是最关键的一步。可以通过PCR扩增、基因文库筛选、化学合成等方法获取目的基因。其中,PCR技术是最常用的方法,可以快速、特异地扩增目的基因。
设计载体:确定需要删除结构域的载体,并选择合适的表达系统和标记。获得原始载体:从商业来源或其他实验室中获取所需的原始载体,这可能是一个普通的质粒或已经包含某些结构域的质粒。构建酶切位点:根据需要删除的结构域,在原始载体上设计引物,包括要添加到质粒的限制酶切位点。
②利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建的方法:将外源DNA片段与线性化的质粒进行连接,形成重组质粒。使用适当的转化方法将构建好的质粒转化到目标细胞中,使其能够进入细胞内。通过适当的筛选方法,如选择性培养基或标记基因的表达,筛选出成功转化的细胞,并通过鉴定转化细胞中的质粒和外源DNA的存在,确认载体构建的成功与否。
克隆质粒载体的构建:首先将目的基因的编码序列与质粒载体的复制子序列连接,构建出重组质粒。然后通过转化将重组质粒导入大肠杆菌中,筛选出含有重组质粒的菌落。表达质粒载体的构建:将目的基因的编码序列与表达调控序列(如启动子和转录终止信号序列)连接,构建出表达质粒。
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