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1. 构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因

1、构建重组载体时用两种限制酶切割目的基因的原因

为了防止目的基因和运载体自身环化。为保证目的基因正序插入运载体，防止反向连接。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

用不同限制酶切割的目的是：保证目的基因和质粒（运载体）的准确连接，避免无效连接过多。可以用不同限制酶切割相同序列的原理：虽然一种限制酶只能识别一种特定的氨基酸序列，但两种限制酶识别的序列可以相包含，例：酶A识别GGATCC序列，酶B识别GATC序列，则GGATCC序列就可以被两种限制酶切割。

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

如果目的基因的两端都有限制酶1的切点，你可以只用一种限制酶1切割，这样目的基因两侧的末端相同，会出现目的基因环化（首尾连接），这不利于目的基因和运载体质粒结合。

取下一段目的基因要切两次，也就是说这里切的两次可以分两种不同的酶来切，同样的，载体也需要切两次同样也是用这两种酶来切，这样有两组碱基的互补配对，就可以避免载体和载体配对以及目的基因和目的基因配对。（不太确定啊。。

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