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1. 关于pET32a载体构建后,双酶切鉴定不正确求助

1、关于pET32a载体构建后,双酶切鉴定不正确求助

一般来说融合蛋白不影响gus的检测，不过影响不影响目的蛋白功能就不一定了。我个人倒是觉得，如果不做定位的的话，gus检测不是那么重要。可以把gus切下去（选用sacI位点）。pcr在基因组合转录组里面都能检测出来就认为目的基因正确表达了。要注意的是如果不融合的话别忘了CDS是要带终止密码子的。

首先得判断蛋白条带是否正确，因为32a表达过程中，会在目标蛋白上加上部分自己序列，所以电泳图谱中你所要表达的蛋白，应该比你自己预期的大20-30kDa。

双酶切质粒或的一条带很正常的，因为多克隆区域切下来的那个小片段太少（总碱基mol量），电泳常常是看不到的，这是常见现象。一条带都没有 不正常。估计是电泳时间不够吧。

有两个方面，一是载体本身酶切不充分，没有完全切开；二是去磷酸化不充分。

pET28a双酶切后连接目的基因什么也不长可以考虑对DNA进行定量。一般来说，设计一个连接反应，载体量最少需要50~100ng，而外源片段的分子数是载体分子数的3~10倍（具体质量取决于你的载体或外源片段的大小）。

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