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1. 如何将线性化载体链接起来

1、如何将线性化载体链接起来

传统方法，也是最经典方法.利用常规taq酶在pcr产物3；末端多加上一个碱基A的特性，开发出3`末端突出一个T的线性化T载体。从而利用DNA分子AT互补配对进行连接提高克隆重组效率。拓展应用的方法。

载体构建的方法：将外源DNA片段与线性化的质粒进行连接，形成重组质粒。使用适当的转化方法将构建好的质粒转化到目标细胞中，使其能够进入细胞内。通过适当的筛选方法，如选择性培养基或标记基因的表达，筛选出成功转化的细胞，并通过鉴定转化细胞中的质粒和外源DNA的存在，确认载体构建的成功与否。

需要连接酶。其主要特征是载体与片段的连接不依赖T4DNA连接酶。恒温一步法载体构建原理是需要连接酶，将载体线性化，通过引物设计，在插入片段两端引入线性化载体的末端序列。

普通的taq聚合酶会在PCR反应过程中在3’末端加入一个碱基A，线性化平末端T载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基，从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。

T载体又叫T质粒载体，是指T4噬菌体DNA连接酶，作用是在有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接. 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。

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