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1. 本实验为什么选择双酶切?双酶切该注意什么?

1、本实验为什么选择双酶切?双酶切该注意什么?

用两种酶是为了得到链状的目的基因，一般是不用一种酶的，比如一种限制性内切酶可以得到 ---TA 的末端，因为DNA是双链，那么目的DNA的两端就可以形成互补（这里由于版面的关系我就不表示出来了，你自己简单的画个示意图就明白），产生一个环状的DNA分子，就很难用于研究了。

同步双酶切选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

双酶切，试验中要注意 做转化的时候，进行酶连接反应时，需要注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时16度。对含有AMP RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。

有两个方面，一是载体本身酶切不充分，没有完全切开；二是去磷酸化不充分。

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