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1. sgRNA设计

1、sgRNA设计

打开网站 http：//crispr.mit.edu ，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列。一般推荐网站设计，因为网站可以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生。当然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列。设计成对的 sgRNA 序列。

如何设计高效的植物sgRNA进行基因编辑 目的基因的获取 （1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。

首先，设计sgRNA犹如寻找基因的黄金钥匙，要求我们选取包含内含子和外显子的互补序列。创新可能受到限制，但可以通过参考已有的成功构建但未使用的序列，以提高效率。crispor.tefor.net这样的在线工具为我们提供了便利，只需输入目标物种和合适的PAM结构，系统会筛选出高评分的候选序列。

首先是实验设计 详情见：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https：//www.jianshu.com/p/8222f449cb44 sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。A）PCR扩增的方法 U6：来源于人U6小核启动子，常用小RNA 表达，转录本为shRNA。

sgrna是single guide RNA（单导向RNA）的缩写。在CRISPR/Cas9系统中sgRNA与gRNA是一个概念。

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