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1. cDNA文库的载体制备

1、cDNA文库的载体制备

cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。

首先，要进行目的基因的获取。这是载体构建的第一步，也是最关键的一步。可以通过PCR扩增、基因文库筛选、化学合成等方法获取目的基因。其中，PCR技术是最常用的方法，可以快速、特异地扩增目的基因。

制备用于克隆cDNA的mRNA Oligotex mRNA Kits （QIAGEN）法 磁珠法分离mRNA 注意：一般需要做mRNA完整性的检测（检查mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力、mRNA分子的大小等）；如果用于制备cDNA文库则还需要检测mRNA在细胞中的丰度。

cDNA文库构建基本步骤：①制备mRNA：全RNA提取与mRNA的分离提纯；②合成cDNA：oligo dT与mRNA3’端poly（A）杂交作为引物合成第一链，第二链合成是以第一链为模板，DNA聚合酶催化。

构建cDNA文库时，需要将双链cDNA与表达载体连接起来，以便将目标基因表达出来。为了保证双链cDNA与表达载体以正确的方向连接，可以采取以下措施：选择合适的限制性内切酶：在连接双链cDNA和表达载体时，需要使用限制性内切酶进行切割。选择合适的限制性内切酶可以保证连接的方向正确。

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